Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/3909
Título: Selecção de ligandos naturais para a purificação de DNA plasmídico por métodos de afinidade
Autor: Tente, Teresa Susana Ferreira
Orientador: Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira
Marcos, João Carlos Ramos Nunes.
Data de Defesa: 2008
Resumo: Nas últimas duas décadas, devido ao crescente interesse do uso de DNA plasmídico como vector não viral na terapia génica, bem como na produção de vacinas de DNA, aumentou significativamente a necessidade de produzir grandes quantidades de DNA plasmídico para fins terapêuticos. Reveste-se assim de grande importância a optimização dos processos de produção e purificação, tendo em vista a obtenção de grandes quantidades de um produto de elevado grau de pureza, com minimização dos custos de produção. Os métodos de separação e purificação baseados em interacções de afinidade são bastante promisssores, devido à sua elevada especificidade, no entanto, os custos elevados das macromoléculas utilizadas como ligandos, limita a sua aplicação potencial generalizada. Assim sendo, há a necessidade de usar outros ligandos mais baratos, surgindo como alternativa as pequenas moléculas que ligam ao DNA, destacando-se os antibióticos antitumorais e agentes anticarcinogénicos. A utilização destas pequenas moléculas como ligandos na purificação de afinidade de DNA plasmídico (pDNA), podem, num futuro próximo, ser implementadas como técnicas preferenciais na purificação de DNA com enorme potencial. O principal objectivo deste trabalho foi testar a possibilidade de utilizar, os antibióticos canamicina e berenil como ligandos de afinidade na purificação de plasmídeos. Foi realizado o estudo da interacção da canamicina e do berenil com um plasmideo modelo (pVAX1LacZ) através da titulação fluorimétrica do pDNA com brometo de etídio (BrEt) pelo método de Strothkam, na ausência e na presença de cada um dos ligandos. Foi também determinada a influência da concentração de cloreto de sódio (NaCl), nesta interacção Os dados foram analisados utilizando o gráfico e a equação de Scatchard tendo-se determinado para cada caso a constante de ligação. Ambos os fármacos estudados apresentam um comportamento competitivo em relação ao BrEt. O berenil parece ser um ligando de afinidade promisor para ser utilisado na purificaçõa de pDNA. De facto, para este ligando e para uma concentração de 1,0 M de cloreto se sódio registou-se uma elevada constante de ligação (12849,00 M-1) que diminui substancialmente para concentrações superiores ou inferiores deste sal. Estes resultados são importantes para uma possível utilização em cromatografia de afinidade, uma vez que sugerem um método simples para a ligação e eluição do plasmídeo de um suporte derivatizado com este ligando. Foi testada a utilização do berenil como ligando em cromatografia de afinidade. Contudo os ensaios preliminares, não foram muito conclusivos, uma vez que, o facto de não se ter conseguido reter o pDNA na coluna, pode ser devido à baixa densidade de ligandos imobilizados na coluna.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/3909
Designação: Mestrado em Bioquímica
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