Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/4404
Título: Study of molecular and cellular pathogenicity mechanisms of Arcobacter species
Autor: Ferreira, Susana Margarida Paraíso
Orientador: Domingues, Fernanda da Conceição
Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues
Oleastro, Mónica Alexandra de Sousa
Palavras-chave: Epidemiologia - Infecções humanas - Portugal
Arcobacter - Patogénese - Portugal
Arcobacter - Epidemiologia - Portugal
Arcobacter - Terapêutica
Data de Defesa: Mai-2014
Resumo: Arcobacter is a genus of Gram-negative, spiral-shaped bacteria in the Epsilonproteobacteria class. It was first proposed in 1991 and was included in the Campylobacteraceae family together with the genera Campylobacter and Sulfurospirillum. There are currently 18 species described, among which A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are known to be human and animal pathogens. Arcobacter genus shows an unusually wide range of habitats, having been isolated from food, water, food processing and handling facilities, diverse environmental, animal and human samples. In fact, consumption of Arcobacter-contaminated food or water is regarded as the most probable cause of infection by this bacterium. Therefore it is important to evaluate its distribution in food or food processing environment, together with the assessment of its genetic variability and other phenotypic and genotypic features associated with virulence potential, to be able to understand the persistence mechanism of Arcobacter in the food chain. Thus, this study intend to evaluate the presence, genetic diversity, and virulence characteristics (namely antibiotic resistance, biofilm-forming capacity and detection of putative virulence genes) of A. butzleri strains isolated from poultry and from the environment of a Portuguese slaughterhouse. A. butzleri isolates revealed a high genetic diversity, with all isolates showing to be susceptible to gentamicin, in contrast to 55.8% that were resistant to ciprofloxacin. The latter resistance was associated with the presence of a cytosine to thymine transition in the quinolone resistance determining region of the gyrA gene. Among selected isolates, 72.2 % presented biofilm-forming ability and in all strains putative virulence genes were detected. These results highlight the relevance of A. butzleri relevance as food-borne pathogen. Taking into account that Arcobacter is potentially transmitted through contaminated food and is resistant to common antimicrobials, it is important to develop alternative control strategies that could be both effective and safe for human consumption. Therefore, the antimicrobial properties of resveratrol against A. butzleri and A. cryaerophilus were studied. Resveratrol exhibited a bacteriostatic or bactericidal activity dependent on cellular growth phase and resveratrol concentration, leading to both DNA content and metabolic activity reduction on Arcobacter cells. Resveratrol also showed the ability to act as an efflux pump inhibitor, and to induce cellular damage. Thus, resveratrol showed anti-Arcobacter activity, with the results obtained suggesting that this compound inhibits this microorganism through different pathways, which together with resveratrol beneficial properties described for human health may encourage its use as a food preservative. Some of the species of Arcobacter genus have been associated with gastrointestinal disease in humans, however there were a lack of studies evaluating its prevalence in Portugal, with the same happening for non-Campylobacter jejuni/coli species. Therefore, the frequency of Arcobacter and Campylobacter species in faeces from patients with diarrhoea in Portugal was assessed using a molecular approach. Concerning, Arcobacter and Campylobacter prevalence and distribution, 298 diarrhoeal samples from Portuguese patients were analysed, 1.3% of the samples were positive for A. butzleri and 0.3 % for A. cryaerophilus. Campylobacter species were found in 31.9 % of diarrhoeic faeces samples, with C. jejuni and C. concisus being the most prevalent species of this genus (13.7 % and 8.0 %, respectively). In this cohort of samples, A. butzleri was the fourth most frequent species. These results evidence the importance of Arcobacter and Campylobacter species as aetiological agents of acute gastroenteritis among Portuguese patients, affecting particularly the paediatric age group. Although A. butzleri has been implicated in human diseases, much of its pathogenesis and virulence factors remain unclear. Thus, A. butzleri virulence potential was also investigated, through the characterization of genotypic and pathogenic properties of human and non- human isolates. The isolates showed to be susceptible to tetracyclines and aminoglycosides, however displaying high resistance to quinolones. A. butzleri demonstrated a weak haemolytic activity and the ability to form biofilms in polystyrene surfaces. Adhesion levels similar to Salmonella Typhimurium were found for A. butzleri on Caco-2 cells, with pre- existing inflammation showing no significant effect on its adherence ability, yet invasion ability showed to vary among the isolates. A. butzleri was able of intracellular survival in Caco-2 cells and to induce a significant up-regulation of interleukin-8 secretion, as well as to promote structural cell disturbance. These data brings new insights to A. butzleri virulence and highlights its pathogenic potential. Overall in this work, the prevalence of Arcobacter species both in human and food-related samples was evaluated, contributing to understanding the epidemiology of Arcobacter in Portugal. The survival and persistence of this organism in the environment was highlighted due to its ability to form biofilms. Its relevance as a human pathogen was underlined by the resistance to antimicrobials, the presence of several putative virulence genes, along with its adherence, invasion, intracellular survival abilities and induction of proinflammatory cytokine secretion in intestinal epithelial cells. Finally, resveratrol was tested as an alternative to control the growth of Arcobacter. This work provided new insights on the epidemiology and pathogenicity of Arcobacter, and also identified a natural compound with anti-Arcobacter activity, which may contribute for future developments of new control approaches.
O género Arcobacter foi proposto em 1991 e faz parte da família Campylobacteraceae juntamente com os géneros Campylobacter e Sulfurospirillum, compreendendo atualmente 18 espécies. Entre as espécies reconhecidas, Arcobacter butzleri, Arcobacter cryaerophilus e Arcobacter skirrowii têm sido associados a doença em humanos e animais. O género Arcobacter está amplamente distribuído, tendo sido isoladas espécies em alimentos, água, instalações de processamento e manipulação de alimentos, diversas amostras ambientais, animais e amostras humanas. Em produtos de origem animal, este microrganismo, tem sido isolado com maior prevalência em frangos, seguido de porco e vaca. O consumo de alimentos ou água contaminados com Arcobacter é considerado como a via de transmissão mais provável. Assim, o conhecimento sobre a distribuição de Arcobacter em alimentos ou ambiente de processamento alimentar, juntamente com a avaliação da variabilidade genética e outras características fenotípicas e genotípicas associadas ao seu potencial de virulência, pode ajudar na compreensão do mecanismo de persistência de Arcobacter na cadeia alimentar e contribuir para o seu controlo. Devido à ausência de estudos prévios sobre a prevalência de Arcobacter em Portugal para humanos ou relativos ao sector alimentar, procedeu-se neste trabalho ao seu isolamento a partir de amostras recolhidas de três bandos de frangos e de superfícies da linha de processamento do matadouro. A. butzleri foi isolado e identificado em todas as amostras recolhidas, com exceção das amostras correspondentes ao conteúdo cecal. Quarenta e três isolados de A. butzleri foram caracterizados por eletroforese em gel de campo pulsado, utilizando as enzimas de restrição Smal e Sacll, revelando uma elevada diversidade genética, com os 43 isolados pertencendo a 32 padrões distintos. No entanto, foram identificados genótipos comuns entre diferentes amostras, indicando a possibilidade de ocorrência de contaminação cruzada durante o processo de abate. Verificou-se ainda neste estudo que os isolados de A. butzleri apresentaram elevados níveis de resistência aos antibióticos em estudo, com todos os isolados a serem resistentes a pelo menos três antibióticos dos nove testados. Enquanto os 43 isolados demonstraram ser suscetíveis à gentamicina e 2,3 % resistentes ao cloranfenicol, 55,8 % das estirpes foram resistentes à ciprofloxacina. Genotipicamente a resistência à ciprofloxacina foi associada a uma transição de citosina para timina na região determinante de resistência às quinolonas do gene gyrA, como previamente descrito. Entre 36 isolados selecionados, 72,2 % apresentaram capacidade de formação de biofilme, o que poderá em parte estar associado à sobrevivência de A. butzleri em ambiente de matadouro, provavelmente por favorecer a dispersão e contaminação cruzada ao longo da linha de processamento. A deteção de genes putativos de virulência por PCR demonstrou a presença dos genes cadF, ciaB, cj1349, mviN, pldA e tlyA em todos os isolados, com uma deteção variável dos genes hecA (75 %), hecB (89 %) e irgA (42 %). Como neste estudo se encontrou uma elevada prevalência de A. butzleri nas amostras estudadas, pressupõe-se que o frango possa ser considerado uma via de transmissão importante para humanos. Este facto associado a diversos fatores de virulência, como elevada resistência a antimicrobianos, capacidade de formação de biofilmes e presença de possíveis genes de virulência, tornam este microrganismo como um patogéneo potencialmente relevante a nível alimentar. A potencial transmissão de Arcobacter através de alimentos contaminados, a elevada prevalência encontrada para A. butzleri e o facto de A. cryaerophilus ser a segunda espécie mais comum associada com alimentos, para além da resistência a antimicrobianos comuns e da sua capacidade de sobreviver a tratamentos físicos e químicos, torna relevante encontrar estratégias alternativas para o seu controlo. Assim sendo, o objetivo seguinte foi centrado na avaliação das propriedades antimicrobianas do resveratrol contra A. butzleri e A. cryaerophilus. O resveratrol exibiu atividade bactericida, levando a uma redução igual ou superior a 3 log10 UFC/mL do inóculo inicial, para células em fase exponencial de crescimento de A. butzleri após 6 horas de incubação com uma concentração de resveratrol de 100 Xg/mL, ou de 200 Xg/mL após 24 horas de incubação com células em fase estacionária. Para as células de A. cryaerophilus em fase exponencial de crescimento, o efeito bactericida foi observado após 24 horas com 100 Xg/mL, enquanto para as células em fase estacionária, a atividade bactericida foi apenas detetada com 200 Xg/mL. Com o objetivo de elucidar o potencial mecanismo de ação deste composto sobre Arcobacter, começou por se avaliar o conteúdo intracelular de ADN e atividade metabólica por citometria de fluxo. Após incubação com resveratrol verificou-se uma diminuição em ambos os parâmetros avaliados. Este composto levou também a um aumento na acumulação de brometo de etídio nas células, demonstrando que o resveratrol pode agir como inibidor de bombas de efluxo, e a uma redução da concentração mínima inibitória de resveratrol pelo inibidor de bombas de efluxo fenilalanina-arginina Z-naftilamida. Para avaliar a ação do resveratrol sobre a morfologia e integridade celular de Arcobacter usou-se a técnica de microscopia eletrónica de varrimento. Com esta técnica verificou-se que o resveratrol provocou desintegração das células de A. butzleri tratadas com concentração mínima inibitória de resveratrol durante 6 horas, enquanto nenhuma alteração morfológica foi observada para as células de A. cryaerophilus. Deste estudo concluiu-se que o resveratrol mostrou elevada atividade anti-Arcobacter e os resultados obtidos sugerem que esta atividade antibacteriana pode resultar da ação do mesmo sobre diferentes alvos celulares, o que pode por sua vez levar à indução de morte celular, em consequência de danos nas funções celulares. Assim, neste estudo foram realçadas as potencialidades antimicrobianas do resveratrol sobre um patogéneo de origem alimentar, Arcobacter. Este aspeto associado ao facto de o resveratrol ser naturalmente sintetizado por plantas em respostas a diversas agressões, e de adicionalmente exibir diversas propriedades descritas como benéficas para a saúde humana e ser um reconhecido antioxidante, encoraja a utilização do resveratrol como um potencial conservante alimentar. O género Arcobacter compreende algumas espécies que têm sido relacionadas maioritariamente com doença gastrointestinal em humanos, no entanto, apesar de algumas serem consideradas patogéneos emergentes, não têm sido vistas como microrganismo de elevada preocupação para a saúde pública. Diversos estudos de prevalência têm apresentado A. butzleri como a quarta espécie mais comum em fezes humanas de indivíduos com gastroenterite, de entre os organismos denominados Campylobacter-like organisms. Assim, foi realizado um estudo de prevalência em 298 amostras de fezes de pacientes com diarreia, recolhidas de 22 hospitais portugueses, entre setembro e novembro de 2012. As amostras foram analisadas quanto à prevalência e diversidade de espécies de Arcobacter e Campylobacter, usando técnicas de deteção molecular. Relativamente às espécies de Arcobacter, 1,3 % das amostras foram positivas para A. butzleri e 0,3% para A. cryaerophilus. Foram encontradas espécies de Campylobacter em 31,9 % das amostras de fezes diarreicas, com C. jejuni e C. concisus sendo as espécies predominantes deste género (13,7 % e 8,0 % , respetivamente). Neste grupo de amostras, A. butzleri foi a quarta espécie mais frequente. Estes resultados evidenciam a importância das espécies de Arcobacter e Campylobacter como agentes etiológicos de gastroenterite aguda entre os pacientes portugueses, afetando particularmente a faixa etária pediátrica. Dado que não existe nenhum trabalho prévio relativo à prevalência e distribuição de Arcobacter em Portugal, este trabalho contribui para um conhecimento da epidemiologia local de Arcobacter, tal como de espécies de Campylobacter. Embora A. butzleri tenha sido implicado em algumas doenças em humanos como diarreia e bacteriémia, ainda são necessários mais estudos para clarificar a patogénese associada a este microrganismo. Assim, o potencial de virulência de A. butzleri foi avaliado através da caracterização genotípica e de propriedades patogénicas de três isolados humanos e três não- humanos. Os isolados mostraram suscetibilidade às tetraciclinas e aminoglicosídeos testados, porém exibindo alta resistência às quinolonas. A. butzleri demonstrou uma atividade hemolítica fraca e capacidade de formar biofilmes em superfícies de poliestireno. Foram demonstrados níveis de adesão semelhantes aos de Salmonella Typhimurium para A. butzleri em células Caco-2, sendo que a inflamação pré-existente das células mostrou não ter efeito significativo sobre a capacidade de adesão dos isolados, no entanto, a capacidade de invasão aumentou significativamente para dois dos isolados humanos. A. butzleri demonstrou capacidade de sobrevivência intracelular em células Caco-2 e de indução significativa da secreção de interleucina-8, assim como demonstrou capacidade de induzir perturbação da estrutura celular. Não foi encontrada correlação entre a presença de genes putativos de virulência e os diferentes fenótipos de patogenicidade. Estes resultados forneceram novas perspetivas acerca da virulência e potencial patogénico de A. butzleri. Em conclusão, este trabalho avaliou a prevalência de espécies Arcobacter tanto em amostras humanas como alimentares o que vem contribuir para um melhor conhecimento acerca da epidemiologia deste microrganismo em Portugal. A sobrevivência e a persistência deste organismo no ambiente foi evidenciada devido à sua capacidade de formação de biofilmes, tal como a sua importância como patogéneo humano foi salientada pela resistência aos antimicrobianos, presença de vários genes de virulência, capacidade de adesão, invasão, sobrevivência intracelular e indução da secreção de citoquinas pró-inflamatórias em células de epitélio intestinal. Para controlar este microrganismo foi ainda testada uma abordagem baseada no resveratrol, um composto de origem natural com o potencial para atuar como conservante na indústria alimentar. Este trabalho permitiu assim ampliar o conhecimento acerca da epidemiologia e patogenicidade de Arcobacter, bem como contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/4404
Designação: Doutoramento em Biomedicina
Aparece nas colecções:FCS - DCM | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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