Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/4452
Título: Alternative specimens in forensic toxicology : analysis of drugs of abuse
Autor: Margalho, Cláudia Isabel Reis
Orientador: Rivadulla Lamas, Manuel Lopez
Gallardo Alba, Maria Eugenia
Gonçalves, Francisco Corte Real
Palavras-chave: Toxicologia forense - Substâncias psicoativas
Drogas ilícitas - Análise toxicológica
Drogas ilícitas - Análise postmortem
Data de Defesa: Abr-2017
Resumo: The main reason for this study’s development lies essentially in the fact that it gathers two areas of great interest and increasing progress in the forensic toxicology field: the postmortem alternative matrices and the new psychoactive substances. Firstly, it is possible to verify that alternative matrices have been playing an important role in the forensic toxicology field throughout the last decade. This relates with the fact they can be used as either a blood/urine complementary or in substitution when their collection is unavailable by several factors. In addition, Portugal and the rest of the world experienced a new emergent trend regarding the consumption of “new psychoactive substances”. This phenomenon brought about major public health injuries. The objective of the presented work was a contribution to the development of new analytical methods for the quantitative determinations of several new psychoactive substances in various biological matrices such as whole blood, plasma, vitreous humor and pericardial fluid. The substances on which we conducted our study were: salvinorin a (main active component of the plant salvia divinorum); some cathinones such as cathine, ephedrine, methcathinone, PMA, mephedrone, methedrone and some phenethylamines belonging to the D series, like the DOM and DOB and those that belong to the 2C-X series like 2C-H, 2C-B, 2C-I, 2C-T-2, 2C-T-4 and 2C-T-7. The mixed-mode was used (cathinones and phenethylamines) and reversed-phase (salvinorin a) adsorbents in the solid phase extraction for preparing samples of 250 μL of blood, plasma and pericardial fluid and 100 μL for vitreous humor. The obtained extracts were further analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry in the SIM mode. To enable the detectability and the separation of the studied cathinones and phenethylamines a fast microwave derivatization procedure was previously applied, using the MBTFA reagent. Thus, in order to minimize the time required for classical techniques of derivatization in the analysis of drugs of abuse (over 30 minutes) a microwave procedure was optimized which lasts only 90 seconds. The method was applied to all substances with the exception of salvinorin a. Stable trifluoroacetyl derivatives were obtained with this optimized methodology. Once confidence in the interpretation of the analytical results was attained (as a prerequisite in forensic and clinical toxicology), it was necessary to ensure that the methods developed were suitable for its intended purposes. Thus, the proposed methodologies were fully validated, in all biological matrices studied according to internationally accepted recommendations. The methods were found to be selective for all tested compounds in all matrices studied. Linearity was achieved from 5-100 ng/mL for salvinorin a and from 5-600 ng/mL for cathinones and phenethylamines. The extraction efficiencies were between 80-100% for salvinorin a and 77-113% for cathinones and phenethylamines, in all the biological matrices studied. All results obtained for the parameters repeatability and intermediate precision presented CV<20% and accuracy were within the acceptance interval of ±20% of the nominal values at all concentration levels. The methods presented limits of quantitation of 5 ng/mL for each compound, in the all biological matrices analysed. The developed methodologies have been applied to authentic samples from autopsies performed in the Clinical and Forensic Pathology Service and in the medico-legal Offices belonging to the delegation of the centre for the National Institute of Legal Medicine and Forensic sciences, I.P. These procedures can be a useful tool in forensic toxicology laboratories. The major contributions are the complementation of the information possibly provided by each one of those fluids regarding drugs’ consumption and the prevention of situations where the blood is not available due to several factors of each individual case. In addition, it was also intended to implement the developed methodologies in routine analysis on the Laboratory of Chemistry and Forensic Toxicology of the centre branch of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences.
A principal razão para o desenvolvimento do presente estudo residiu essencialmente no facto de que nele se reuniram duas áreas de crescente interesse no campo da toxicologia forense: as amostras alternativas postmortem e as novas substâncias psicoativas. Em primeiro lugar, é possível verificar que as matrizes alternativas têm tido um papel importante no campo de toxicologia forense ao longo da última década, principalmente devido às vantagens que apresentam quando usadas em complementaridade com o sangue e/ou urina ou em sua substituição, quando as suas colheitas são inviabilizadas por diversos fatores (carbonização, hemorragia extensa, politraumatizados, avançado estado putrefativo etc.). O recurso a diferentes matrizes biológicas postmortem, na condução de uma análise toxicológica, constitui um verdadeiro desafio para a toxicologia forense pois são necessárias metodologias suficientemente sensíveis para proceder ao isolamento dos diferentes analitos que eventualmente estejam presentes em baixas concentrações nas amostras a analisar. No entanto, entende-se que uma análise toxicológica conduzida em distintas matrizes biológicas permite uma interpretação mais completa do caso, já que cada uma delas poderá fornecer uma perspetiva particular sobre a anterior exposição a determinadas substâncias. Mais problemático, e não menos raros, são os casos em que a quantidade de sangue é insuficiente ou mesmo inexistente, para realizar a investigação pericial. Nestes casos, o humor vítreo (VH) e o líquido pericárdico (PF) poderão ser usados como alternativa viabilizando, deste modo, a realização da análise. Apesar de escassos, os estudos realizados em VH na determinação de anfetaminas e metanfetaminas e de novas substâncias psicoativas, demonstram que existe uma boa correlação entre a concentração das substâncias encontradas e as correspondentes no sangue. Esta situação poderá ser justificada pelo facto de o VH ser maioritariamente composto por água (99%), possuir um pH de 7.5 (semelhante ao do sangue) e não ter atividade metabólica significativa. A maior desvantagem desta matriz é o limitado volume de amostra (1 a 3 mL) que não permite uma análise extensiva a várias substâncias. No caso do líquido pericárdico, o volume de amostra acessível para análise é de 5 a 10 mL, no entanto esta matriz tem sido pouco estudada. Os poucos trabalhos existentes demonstram que esta matriz poderá ser uma útil alternativa ao sangue uma vez que apresenta uma boa correlação das concentrações das substâncias encontradas nestas amostras. A maior desvantagem que esta matriz apresenta é a possibilidade de ser contaminada por fenómenos de difusão postmortem, resultantes de uma elevada concentração das drogas eventualmente presentes no estômago. Uma vez que, em Portugal e por todo o mundo se tem assistido a uma nova tendência emergente em relação ao consumo das "novas substâncias psicoativas" (NSP) que se encontra associada a diversos perigos na saúde pública, afigurou-se relevante realizar este estudo. O presente trabalho foi direcionado para substâncias pertencentes aos grupos mais representativos em termos de consumo e grau de toxicidade: catinonas, fenetilaminas e salvia divinorum. Em Portugal, esta realidade alastrou-se de forma discreta, sem receber a atenção devida por parte de todas as entidades competentes, estando estreitamente associada à abertura das lojas designadas por “smartshops”. Consequentemente, entre a abertura da primeira loja (que ocorreu em 2007) e 2013, foram registadas cerca de 40 lojas especializadas e dedicadas exclusivamente ao comércio destas NSP. Com a entrada em vigor do Decreto-lei nº 54/2013 de 17 Abril de 2013, estes locais foram encerrados por motivo da proibição da venda destas substâncias. No entanto, a comercialização e consumo destas substâncias não cessou o que é confirmado por estudos de monitorização da venda destas substâncias no espaço europeu, promovidos pelo Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência (OEDT) e Europol. Novas substâncias continuam em ascendente proliferação o que é indicador da existência de redes de larga escala de produção e distribuição. Deste modo, este trabalho pretendeu contribuir para o desenvolvimento de metodologias analíticas para determinações quantitativas de várias destas novas substâncias psicoativas em distintas matrizes biológicas tais como: sangue total, plasma, humor vítreo e líquido pericárdico. As substâncias sobre as quais realizámos o nosso estudo foram: salvinorina a (principal componente ativo da planta Salvia divinorum); algumas catinonas como: metcatinona, PMA, mefedrona e metedrona; e algumas fenetilaminas tais como: catina, efedrina, DOM, DOB e as pertencentes à série 2C-X: 2C-H, 2C-B, 2C-I, 2C-T-2, 2C-T-4 e 2C-T- 7. Para a preparação de volumes de 250 μL de amostras de sangue, plasma e líquido pericárdico e de 100 μL de humor vítreo foi usada a extração em fase sólida (SPE). Atualmente, a SPE é uma das técnicas mais usadas na extração e/ou concentração de amostras complexas, que viabiliza a deteção de compostos em concentrações reduzidas por técnicas cromatográficas especializadas, como a cromatografia de gases e a líquida acopladas à espectrometria de massa (GC-MS e LC-MS). Neste estudo, os extratos foram obtidos por GC-MS em modo SIM. Para habilitar a deteção e a separação das substâncias, por esta técnica cromatográfica, foi previamente aplicado um procedimento de derivatização através do uso de micro-ondas. Este procedimento, com duração de apenas 90 segundos, foi otimizado de forma a minimizar o consumo de tempo (superior a 30 minutos) que é geralmente despendido nas técnicas clássicas de derivatização para a análise de drogas de abuso. Tratando-se de uma técnica analítica pouco estudada na área da toxicologia forense, oferece-nos significativas vantagens em termos de rapidez na derivatização completa dos compostos. O método foi aplicado a todas as substâncias, com exceção da salvinorina a, tendo sido obtidos derivados trifluoroacetilados estáveis. Dado que a confiança na interpretação dos resultados analíticos é um pré-requisito em toxicologia forense e clínica, foi necessário garantir que os métodos desenvolvidos eram adequados para os fins pretendidos. Assim, as duas metodologias desenvolvidas foram validadas, em todas as matrizes biológicas estudadas de acordo com normas preconizadas internacionalmente para a validação de métodos bioanalíticos. No decurso da validação foram estudados os seguintes parâmetros analíticos: seletividade, intervalos de linearidade, fenómenos de arrastamento entre amostras de maior concentração para outras de concentração mais baixa, limites de deteção e de quantificação (LOD e LLOQ), precisão (intra-dia e intermédia) e exatidão, eficiência do processo extrativo e estabilidade (permanência dos extratos no amostrador em condições ambientais por 48 h, permanência das amostras na bancada de trabalho por períodos de 3h, ciclos de congelação e descongelação ao longo de 7 dias). Os métodos foram considerados seletivos para todos os compostos estudados e em todas as matrizes analisadas. Foi obtida linearidade dentro das gamas de trabalho estudadas (5-100 ng/mL para a salvinorina a e 5-600 ng/mL para as catinonas e fenetilaminas) com coeficientes de correlação superiores a 0.99. Os valores obtidos de recuperação variaram entre 77% (2C-T- 4 a 20 ng/mL) e 113% (2C-H a 500 ng/mL) para cada composto analisado nas diferentes matrizes biológicas estudadas. Verificou-se que todos os resultados obtidos para os parâmetros de repetibilidade e precisão intermédia apresentaram valores de CV<20% e que a exatidão se situou dentro do intervalo de ±20% dos valores nominais, em todos os níveis de concentrações estudados. Os métodos apresentaram valores de LOD e LLOQ de 5 ng/mL para cada um dos compostos, em todas as matrizes biológicas. As amostras não processadas que permaneceram no laboratório à temperatura ambiente durante 3h (para todas as substâncias analisadas) e os extratos deixados no amostrador (nas condições a que se encontra o sistema de GC-MS) por períodos até 24 h (salvinorina a) e 48 h (catinonas e feniletilaminas) revelaram-se estáveis. Por último, não foi verificada degradação dos compostos após três ciclos de congelação e descongelação completa ao longo de sete dias. As metodologias desenvolvidas foram aplicadas a amostras resultantes de autópsias realizadas no serviço de Clínica e de Patologia Forenses e nos Gabinetes médico-legais pertencentes à delegação do centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. Estes procedimentos poderão ser uma ferramenta bastante útil em laboratórios de toxicologia forense. Até ao momento, estas substâncias não tinham sido simultaneamente estudadas em amostras postmortem de humor vítreo e líquido pericárdico. As metodologias validadas foram implementadas nas análises de rotina do serviço de Química e Toxicologia Forenses da delegação do centro do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/4452
Designação: Doutor em Bioquímica
Aparece nas colecções:FC - DQ | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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