Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/4775
Título: Coadministration of antiepileptic drugs and P-glycoprotein inhibitors of flavonoid-type
Outros títulos: A strategy to overcome the drug resistance in epilepsy
Autor: Ferreira, Ana Filipa da Silva
Orientador: Alves, Gilberto Lourenço
Ferreira, Amílcar Celta Falcão Ramos
Palavras-chave: Epilepsia - Fármacos antiepiléticos
Epilepsia - Farmacologia
Epilepsia - Farmacorresistência
Flavonoides
Data de Defesa: Mar-2018
Resumo: The resistance to antiepileptic drugs (AEDs) remains a major unsolved therapeutic problem, which affects 30-40% of patients with epilepsy. The overexpression of multidrug efflux transporters, as the P-glycoprotein (P-gp), at the level of the blood-brain barrier of epileptic patients has been suggested as a key mechanism underlying the refractory epilepsy. Bearing this in mind, efforts have been made to search for therapeutically useful P-gp inhibitors. In an attempt to find potent and safer P-gp inhibitor drugs, a particular emphasis has been given to flavonoid compounds. Actually, apart from their potential value as P-gp inhibitors, these phytochemical compounds have been recognised as having a panoply of important pharmacological properties like anti-inflammatory, antioxidant, antitumoral, antimicrobial, antiviral, hormonal and even anticonvulsant effects. Taking this into account, the purpose of the present thesis was to conduct a comprehensive in vitro and in vivo evaluation of the potential of flavonoids as P-gp inhibitors, but also to explore a strategy of flavonoid/AED combined therapy as a possible approach to overcome the P-gp–mediated pharmacoresistance in epilepsy. This project involved the development and validation of appropriate and reliable bioanalytical techniques to support the accomplishment of the intended studies. Thus, high-performance liquid chromatography methods coupled with diode array detection (HPLC-DAD) were properly validated for the quantification of the target AEDs and some of their main metabolites in cell culture samples and in rat plasma and brain matrices. An additional HPLC-DAD technique was also developed to quantify several AEDs and metabolites in human plasma, which has shown to be a useful tool for the therapeutic drug monitoring in the clinical practice. According to the results of a set of in vitro assays, five out of eleven flavonoids tested, namely baicalein, (-)-epigallocatechin gallate [(-)-EPG], kaempferol, quercetin and silymarin demonstrated to have an interesting potential in inhibiting the P-gp activity. These promising flavonoids also promoted a significant increase in the intracellular accumulation of the AEDs carbamazepine (CBZ), oxcarbazepine (OXC) and phenytoin (PHT) and their active metabolites carbamazepine-10,11-epoxide (CBZ-E) and licarbazepine (LIC) in the Madin-Darby canine kidney cell line transfected with the human multidrug resistance-1 gene which encodes the human P-gp (MDCK-MRD1), showing up as important drug candidates to overcome the AED-resistance. Actually, excluding LTG, all the AEDs tested (CBZ, OXC and PHT) as well as their active metabolites (CBZ-E and LIC) were found to be P-gp substrates in the MDCK-MDR1 cells. Additionally, CBZ, CBZ-E, LIC, LTG, OXC and PHT promoted a statistically significant decrease of the intracellular concentration of rhodamine 123 (a classic P-gp probe substrate), suggesting an inducer effect on the functional activity of P-gp. An assessment of the potential synergic effects of baicalein, (-)-EPG, kaempferol, quercetin and silymarin on the P-gp inhibition was also performed, firstly in in vitro conditions and then in in vivo experiments. Indeed, when compared to their individual activity, some dual flavonoid combinations exhibited an increased potential in inhibiting the P-gp in the in vitro assays. Moreover, the dual combinations of (-)-EPG/silymarin and kaempferol/baicalein demonstrated a great potential in enhancing the intracellular accumulation of CBZ, OXC and PHT and their metabolites CBZ-E and LIC in the MDCK-MDR1 cells and such effects were comparable to those promoted by verapamil (the standard P-gp inhibitor). The effect of the combination of (-)-EPG/silymarin was also tested in transport assays of LIC (P-gp substrate) through MDCK-MDR1 cells mounted in Ussing chambers; as expected, this combination of flavonoids increased the apparent permeability coefficient of LIC. Overall, these in vitro findings were further supported by in vivo results. In fact, after the pretreatment of male Wistar rats with silymarin an increasing in the plasma concentrations of the studied AEDs (CBZ, OXC and PHT) was observed. Nevertheless, it should be highlighted that the main effects induced by silymarin were found on the OXC pharmacokinetics, for which was found a statistically significant increase in the peak plasma concentration (50%) and in the extent of systemic exposure (41%), having a direct impact on the drug concentrations reached in the brain. On the other hand, the use of dual combinations of (-)-EPG/silymarin on the inhibition of the activity of P-gp was also evaluated in vivo in Wistar rats, being noticeable the synergic potential of (-)-EPG/silymarin combinations in enhancing the degree of systemic exposure to OXC and LIC (a pharmacologically active metabolite of OXC), and it occurred in a comparable extent to that observed for verapamil (positive control). Indeed, the pretreatment of male Wistar rats with dual silymarin/(-)-EPG combinations originated peak plasma concentrations of OXC similar to those achieved in the presence of verapamil. Moreover, the effects promoted by silymarin/(-)-EPG combinations on the magnitude of systemic drug exposure were also reflected in the corresponding drug levels attained in the brain (biophase). Hence, according to our findings, it seems that the flavonoid/AED combined therapy can be thought as a promising approach that should continue to be exploited in order to overcome the P-gp–mediated pharmacoresistance. The availability of this in vitro and in vivo information also adds support to the efflux transporter hypothesis in explaining the pharmacoresistant epilepsy. Considering all its intrinsic potential and indisputable properties, the flavonoid-type compounds may emerge as an alternative to the available P-gp inhibitors for a prospective management of patients with drug-refractory epilepsy.
A epilepsia é uma das doenças neurológicas crónicas mais comuns e tem um grande impacto negativo na qualidade de vida dos doentes, sendo de extrema importância os esforços continuados para desenvolver novos fármacos antiepiléticos e novas abordagens terapêuticas. Contudo, apesar dos avanços significativos alcançados nos últimos anos, os fenómenos de farmacorresistência associados aos fármacos antiepiléticos são provavelmente um dos principais problemas no que diz respeito à terapêutica da epilepsia, afetando 30-40% dos doentes. De facto, esta situação tem proporcionado um ímpeto crescente para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras e mais eficazes. A sobreexpressão de transportadores de efluxo de fármacos, como a glicoproteína-P (P-gp), ao nível da barreira hematoencefálica, tem sido sugerida como um dos principais mecanismos subjacentes à epilepsia refratária. Desta forma, vários esforços têm sido realizados no sentido de descobrir e desenvolver inibidores da P-gp que sejam úteis de um ponto de vista terapêutico. No entanto, as múltiplas desvantagens apresentadas pelas primeiras gerações de inibidores da P-gp demonstraram a necessidade de encontrar agentes mais potentes e mais seguros, tendo sido dado um ênfase especial nos últimos anos a compostos flavonoides. Além do seu interesse potencial como inibidores da P-gp, uma panóplia de outras propriedades farmacológicas importantes têm sido atribuídas a estes compostos fitoquímicos, entre as quais, por exemplo, efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, antitumorais, antimicrobianos, antivirais, hormonais e, mesmo, anticonvulsivantes. Tendo em consideração todos estes aspetos, a presente tese teve como principal objetivo realizar uma avaliação abrangente, in vitro e in vivo, do papel potencial dos flavonoides como inibidores da P-gp, e também explorar uma estratégia de terapia combinada de flavonoides/fármacos antiepiléticos como possível abordagem para superar a farmacorresistência verificada na epilepsia. Este projeto envolveu o desenvolvimento e validação de técnicas bioanalíticas apropriadas e fiáveis para apoiar a execução dos estudos pretendidos. Neste contexto, métodos de cromatografia líquida de alta eficiência acoplados à deteção por fotodíodos (HPLC-DAD) foram devidamente desenvolvidos e validados para a quantificação dos fármacos antiepiléticos alvo de interesse e de alguns dos seus principais metabolitos em amostras de cultura celular e em matrizes de plasma e cérebro de rato. Uma técnica adicional de HPLC-DAD foi também desenvolvida para a quantificação de vários fármacos antiepiléticos e metabolitos em plasma humano, constituindo uma ferramenta útil para apoiar a monitorização terapêutica destes fármacos na prática clínica. De acordo com os resultados obtidos num conjunto de ensaios in vitro, cinco dos onze flavonoides testados, nomeadamente, a baicaleína, a (-)-epigalocatequina galato [(-)-EPG], o kaempferol, a quercetina e a silimarina demonstraram ter um potencial interessante na inibição da atividade da P-gp. Estes flavonoides promoveram também um aumento significativo da acumulação intracelular dos fármacos antiepiléticos carbamazepina (CBZ), oxcarbazepina (OXC) e fenitoína (PHT), e dos seus metabolitos ativos carbamazepina-10,11-epóxido (CBZ-E) e licarbazepina (LIC), na linha celular Madin-Darby canine kidney, transfetada com o gene de resistência a múltiplos fármacos 1 (MDR1) que codifica para a P-gp humana (MDCK-MRD1), evidenciando-se como candidatos promissores para reverter a resistência associada aos fármacos antiepiléticos. Além disso, com exceção da lamotrigina (LTG), todos os fármacos antiepiléticos testados (CBZ, PHT e OXC), assim como os seus respetivos metabolitos ativos (CBZ-E e LIC), demonstraram ser substratos da P-gp neste modelo celular. Adicionalmente, a CBZ, CBZ-E, LIC, LTG, OXC e PHT promoveram uma diminuição significativa nas concentrações intracelulares de rodamina 123 (um substrato “sonda” clássico da P-gp), o que sugere um efeito indutor, mediado pelos próprios fármacos e metabolitos, da atividade funcional da P-gp. Reconhecendo-se as várias propriedades biológicas atribuídas aos flavonoides e tendo-se em consideração que misturas complexas de flavonoides são consumidas diariamente na nossa dieta, não se poderá ignorar o seu potencial farmacológico sinérgico. Neste sentido, foi concretizada uma avaliação dos potenciais efeitos sinérgicos da baicaleína, (-)-EPG, kaempferol, quercetina e silimarina relativamente à inibição da P-gp, primeiro in vitro e depois in vivo. Na verdade, comparativamente aos resultados individuais obtidos, algumas combinações duais de flavonoides apresentaram um potencial acrescido para inibição da P-gp in vitro. Além disso, algumas dessas combinações, nomeadamente (-)-EPG/silimarina e kaempferol/baicaleína, proporcionaram um aumento substancial da acumulação intracelular de CBZ, OXC e PHT, bem como dos seus metabolitos CBZ-E e LIC, na linha celular MDCK-MDR1, sendo estes efeitos comparáveis aos obtidos com o verapamilo, inibidor de referência da P-gp. Assim, enquanto os flavonoides baicaleína, (-)-EPG, kaempferol, quercetina e silimarina testados individualmente aumentaram em 1,2 a 31 vezes a acumulação intracelular dos fármacos antiepiléticos e metabolitos ativos considerados nas células MDCK-MDR1, as combinações duais desses flavonoides permitiram alcançar aumentos de cerca de 1,5 a 76 vezes. Adicionalmente, o efeito da combinação da (-)-EPG com a silimarina foi também avaliado em ensaios de transporte com a LIC (substrato da P-gp) através de uma monocamada de células MDCK-MDR1 montadas em câmaras de Ussing; como esperado, esta combinação aumentou o coeficiente de permeabilidade aparente da LIC. Em geral, os resultados dos estudos in vitro foram suportados pelos resultados dos estudos in vivo. De facto, após pré-tratamento de ratos Wistar machos com silimarina observou-se um aumento nas concentrações plasmáticas dos fármacos antiepiléticos alvo (CBZ, OXC e PHT). No entanto, é de ressaltar que os principais efeitos induzidos pela silimarina foram notados na farmacocinética da OXC, para a qual foi observado um aumento estatisticamente significativo na sua concentração plasmática máxima (50%) e na sua extensão de exposição sistémica (41%), tendo tais efeitos um impacto direto nas concentrações farmacológicas alcançadas no cérebro. Por outro lado, o uso de combinações duais de (-)-EPG/silimarina na inibição da atividade da P-gp foi também avaliado in vivo em ratos Wistar, sendo evidente o potencial sinérgico destesdois flavonoides no aumento do grau de exposição sistémica à OXC e LIC (metabolito farmacologicamente ativo da OXC), o que ocorreu numa extensão comparável à observada para o verapamilo (controlo positivo). De facto, o pré-tratamento de ratos Wistar com combinações de silimarina/(-)-EPG originou concentrações plasmáticas máximas de OXC semelhantes àquelas obtidas na presença do verapamilo. Além disso, os efeitos promovidos pelas combinações de silimarina/(-)-EPG no que diz respeito à magnitude da exposição sistémica ao fármaco foram também refletidos nos níveis de OXC e LIC alcançados no cérebro (biofase). Assim, de acordo com os nossos resultados, a terapia combinada de flavonoides/fármacos antiepiléticos pode ser considerada como uma abordagem promissora que deve continuar a ser explorada no sentido de superar a farmacorresistência mediada pela P-gp. A disponibilidade desta informação resultante de ensaios in vitro e in vivo contribui também para apoiar a hipótese do envolvimento de transportadores de efluxo, em particular da P-gp, na condição de epilepsia farmacorresistente. Considerando todo o seu potencial intrínseco e propriedades biológicas indiscutíveis, os compostos de tipo flavonoide podem então emergir como uma alternativa aos inibidores da P-gp disponíveis para um tratamento prospetivo dos doentes com epilepsia refratária.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/4775
Designação: Doutaramento em Ciências Farmacêuticas
Aparece nas colecções:FCS - DCM | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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