Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/6789
Título: Construção de um vetor de expressão de Transtirretina
Autor: Xistra, Vera Mónica de Almeida
Orientador: Santos, Cecília Reis Alves dos
Palavras-chave: Doença de Alzheimer
Nanopartículas
Pei
Terapiagénica
Ttr
Vetores de Expressão
Data de Defesa: 10-Nov-2016
Resumo: A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que afeta, aproximadamente, 48 milhões de pessoas a nível mundial e caracteriza-se por alterações cognitivas, perda de memória e alteração comportamental derivadas da falência progressiva dos neurónios. Esta falência possui diversas causas sendo de evidenciar a agregação de péptido ß-amilóide (Aß) e a acumulação de agregados neurofibrilares da proteína Tau. A transtirretina (TTR) é uma proteína cujas principais funções são: transporte, neuroprotecção e modulação, prevenindo a toxicidade do péptido Aß. É sintetizada no fígado e no plexus coróide. A terapia génica tem um potencial relevante para o tratamento de inúmeras doenças, incluindo a DA. Esta terapia é baseada na utilização de vetores de expressão que são inseridos em sistemas de entrega e introduzidos em hospedeiros que traduzem esses fragmentos de DNA em proteínas promovendo a sua expressão e auxiliando no tratamento das patologias. Com este projeto pretendeu-se construir um vetor de expressão não-viral que codifique para a TTR para utilização, como terapia génica, na DA. Este vetor foi nanoencapsulado com PEI e transfectado em células neuronais seguida de avaliação da expressão da TTR por Western Blot. Tendo em conta os objetivos deste projeto, construiu-se o vetor pCAG-hTTR que foi replicado em E.coli DH5a, purificado e inserido em nanopartículas formuladas com polietilenimina (PEI). A eficiência de encapsulação foi superior a 96% e o potencial zeta de -35,43±0,38 a 2,66±1,19 mV. Posteriormente, as células N27 que não apresentaram produção endógena de TTR foram transfectadas com o vetor pCAG-hTTR encapsulado com PEI. O ensaio da viabilidade celular efetuado 48h após a transfecção mostrou que esta foi superior a 78% diminuindo significativamente nas 72h subsequentes à transfecção. A proteína total extraída das células transfetadas foi quantificada e analisada por western blot. Os resultados foram inespecificos com marcação da TTR obtida até nos controlos negativos, sugerindo que o anticorpo utilizado não será o mais adequado ou uma transfecção ineficiente. Em suma, pela primeira vez foi possível construir um vetor de expressão que codifique para a TTR com a finalidade de promover a sua expressão e criar um sistema de entrega de nanopartículas formuladas com PEI para promover a sua entrega às células alvo. Contudo, não foi possível confirmar a sua expressão nas células transfetadas nem a eficiência de transfecção.
Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that affects approximately 48 million people worldwide and is characterized by cognitive impairment, memory loss and behavioral changes derived from the progressive failure of neurons. This failure has several causes, highlighting the aggregation of ß-amyloid peptide (Aß) and the accumulation of neurofibrillary aggregates of tau protein. Transthyretin (TTR) is a protein whose main functions are: transportation, neuroprotection and modulation, preventing the toxicity of Aß peptide. It is synthesized in the liver and choroid plexus. Gene therapy has a significant potential for treatment of numerous diseases, including AD. This therapy is based on the use of expression vectors that are inserted into delivery systems and introduced into hosts which translate these DNA fragments in protein promoting its expression and aiding in the treatment of diseases. This project was intended to construct a non-viral expression vector encoding for the TTR to use as gene therapy, against AD. This vector was nanoencapsulated with polyethyleneimine (PEI) and then transfected in neural cells followed by evaluation of the expression of TTR by Western blot. Taking into account the objectives of this project, the pCAG-hTTR vector was constructed and replicated in E. coli DH5a purified, and inserted into nanoparticles formulated with PEI. The encapsulation efficiency was greater than 96% and the zeta potential range from 35.43 ± 0.38 to 2.66 ± 1.19 mV. Then the N27 cell line wich showed no endogenous production of TTR was transfected with the pCAG-hTTR vector encapsulated with PEI. The cell viability assay performed 48 hours after transfection showed that it was greater than 78% significantly decreases the 72h after transfection. Total protein extracted from transfected cells was quantified and analyzed by western blot. The results were nonspecific with TTR labeling obtained even in the negative controls, suggesting that the antibody used was not be the most suitable or that transfection efficiency was very low. In short, it was possible to construct an expression vector coding for TTR for the first time with the purpose of promoting its expression and creating a delivery system formulated with PEI nanoparticles to target neuronal cells. However, it was not possible to confirm their expression in transfected cells nor its transfection efficiency.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/6789
Designação: 2º Ciclo em Bioquímica
Aparece nas colecções:FC - DQ | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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