Cruz, Carla Patrícia Alves Freire MadeiraSousa, Fani Pereira deFerreira, João Miguel Machado2018-08-292018-08-292015-11-132015-10-2http://hdl.handle.net/10400.6/5844Apesar do DNA se encontrar geralmente na forma de dupla hélice, este também pode formar outras estruturas que desempenham um papel importante no controlo de vários processos celulares como a transcrição, replicação e recombinação. Um exemplo dessas estruturas são os G-quadruplex que têm sido considerados como potenciais alvos terapêuticos no tratamento de doenças como o cancro. A síntese de moléculas de baixo peso molecular (< 500 Da) com capacidade de induzir e estabilizar estruturas do G-quadruplex, provou ser uma ferramenta para a síntese de uma nova classe de agentes anticancerígenos. O plasmídeo pVAX-G4, que foi produzido através da fermentação da E. coli DH5a, contém uma sequência com 58 pb, a 58S?3, que possui a capacidade para formar G-quadruplex durante a transcrição. Em estudos anteriores verificou-se que a predominância destas estruturas é maior na isoforma superenrolada (sc) do que nas isoformas circular aberta (oc) ou linear (ln). Neste trabalho sintetizaram-se ligandos derivados de quinolina (L4) e naftaleno (L5, L6 e L7), com o objetivo de induzirem e estabilizarem a estrutura do G-quadruplex 58S?3. A indução e estabilização da estrutura de G-quadruplex pelos ligandos L4, L5, L6 e L7 foi avaliada por espetroscopia de dicroísmo circular. Verificou-se que a sequência 58S?3 forma uma estrutura G-quadruplex paralela na presença de 100 mM de KCl. Após adição dos ligandos esta estrutura mantém-se, verificando-se ainda o aumento da sua estabilidade térmica entre 4ºC e 7ºC. Posteriormente sintetizaram-se os suportes cromatográficos a partir da imobilização do ligando L5 na Sefarose por dois métodos químicos diferentes. No primeiro método o ligando foi imobilizado na Sefarose através do braço espaçador 1,4-butanodiol diglicidil éter, dando origem ao suporte A. No segundo método o ligando foi imobilizado diretamente na Sefarose ativada com CNBr sem o braço espaçador, dando origem ao suporte B. Ensaios cromatográficos iniciais, realizados em mini-colunas de bancada, demonstraram que o suporte A apresentava interação com o plasmídeo modelo pVAX-LacZ tanto em condições favorecendo interações iónicas como hidrofóbicas, mostrando potencial para a purificação da isoforma sc. A purificação desta isoforma de ambos os plasmídeos (pVAX-LacZ e pVAX-G4) utilizando o suporte A, foi posteriormente otimizada no sistema AKTA Avant, utilizando um gradiente por passos crescente. No primeiro passo foi usada uma solução de 0,15 M de NaCl em Tris-HCl 10 mM (pH 8) e no segundo passo uma solução de 1,5 M de NaCl em Tris-HCl 10 mM (pH 8) à temperatura de 4ºC. Por fim, foi realizada a transcrição in vitro da isoforma sc do pVAX-G4 resultante da purificação, de forma a comprovar a formação da estrutura G-quadruplex. A análise dos espetros de dicroísmo circular evidenciou que o transcrito adota a estrutura de G-quadruplex paralela.Although DNA is usually found in double helix, it can also form other complex structures which play important roles on regulating several cellular processes like transcription, replication and recombination. An example of these alternative structures is G-quadruplex. Nowadays, the G-quadruplexes are viewed as a potential therapeutic targets for several diseases, like cancer. The synthesis of molecules with low molecular weight (< 500 Da) which can induce and stabilize G-quadruplex structures, is viewed as a new class of anticancer agents. The plasmid pVAX-G4, which was amplified by a cell culture of E. coli DH5a, contains a sequence of 58 bp (58S?3) that is capable of forming G-quadruplex structures during transcription. Previous studies shown that the formation of these structures occurs more frequently on supercoiled (sc) isoform than open-circular (oc) and linear (ln) isoforms. In this work were synthesized quinoline (L4) and naphthalene (L5, L6 and L7) based ligands in order to induce and stabilize the G-quadruplex structure formed by 58S?3. The induction and stabilization of G-quadruplex structure by L4, L5, L6 and L7 ligands was measured by circular dichroism spectroscopy. It was found that the sequence 58S?3 folds into a parallel G-quadruplex structure in presence of 100 mM KCl. After ligands addition it was noticed that they interact with DNA maintaining its structure and improving thermal stability in values between 4ºC and 7ºC. After that two chromatographic supports were synthesized by immobilizing ligand L5 into Sepharose by two different chemical methods. In the first one, the ligand was immobilized into Sepharose using 1,4-butanediol diglycidyl ether spacer arm (Support A) and in the second method it was immobilized in CNBr-activated Sepharose without spacer arm (Support B). An initial screening revealed that support A has the potential to be used in purification once it interacts with the model plasmid pVAX-LacZ using conditions either favoring electrostatic or hydrophobic interactions. Purification of sc pVAX-G4 and pVAX-LacZ was carried on AKTA Avant system, using an increasing stepwise gradient from 0,15 M NaCl in 10 mM Tris-HCl (pH 8) to 1,5 M NaCl in 10 mM Tris-HCl ( pH 8) at 4ºC. Purification of sc isoform was achieved but it was not completely recovered. Finally, sc pVAX-G4 resultant from purification was in vitro transcribed to induce G-quadruplex formation which was confirmed by circular dichroism. CD spectra showed that the transcript folds into a parallel G-quadruplex structure.porCromatografia de AfinidadeDicroísmo CircularG-QuadruplexIsoforma ScLigandos HeterocíclicosPvax-G4master thesis201642921