Lemos, Manuel Carlos Loureiro deGonçalves, Catarina Inês Nunes PiresCarriço, Josianne Nunes2025-09-242025-09-242025-09-05http://hdl.handle.net/10400.6/18937O desenvolvimento pubertário é um processo fisiológico complexo que resulta da interação entre o sistema neuroendócrino, fatores genéticos e ambientais. Inicia-se com a reativação do eixo Hipotálamo-Hipófise-Gónadas, levando à produção de gonadotrofinas, hormonas sexuais e consequente desenvolvimento dos carateres sexuais secundários. O Hipogonadismo Hipogonadotrófico Congénito (HHC) é uma doença endócrina rara que, na adolescência, se manifesta clinicamente com ausência completa ou parcial do desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários. Na idade adulta, os sintomas incluem ausência de virilização e disfunção erétil no sexo masculino, amenorreia primária no sexo feminino, ausência de líbido e infertilidade em ambos os sexos. O HHC caracteriza-se pela ausência ou diminuição da produção, secreção ou ação da hormona libertadora de gonadotrofinas. Em 50 a 60% dos casos associa-se a anosmia/hiposmia (Síndrome de Kallmann) ou a outras anomalias congénitas. O diagnóstico do HHC baseia-se na anamnese, observação de sinais clínicos, levantamento de sintomas e exames laboratoriais e imagiológicos. Contudo, desde o início do século XXI, o conhecimento sobre as causas genéticas do HHC tem avançado na mesma medida que o desenvolvimento das tecnologias de sequenciação genética. A disponibilidade das tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS) proporcionou grandes avanços no diagnóstico molecular destes doentes. Este estudo teve como objetivo investigar as causas genéticas do HHC em doentes portugueses, utilizando a NGS, ferramentas in silico e técnicas de biologia molecular. Foram estudados 81 doentes com HHC e 263 controlos portugueses. O ADN genómico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico e submetido à sequenciação do exoma completo. A partir das bases de dados OMIM® e Pubmed, identificaram-se 169 genes relacionados com o fenótipo de HHC, que foram incluídos num painel virtual. As variantes encontradas nesses genes foram filtradas com base na frequência populacional e localização no genoma, sendo classificadas conforme os critérios do American college of medical genetics and genomics e da Association for molecular pathology (ACMG-AMP) em cinco níveis, de benignas a patogénicas. Para avaliar o impacto de variantes com potencial para alterar o splicing, utilizou-se o método de minigene. A análise das variantes germinativas permitiu identificar a causa genética do HHC em 24 dos 81 doentes estudados (29,6%). As variantes causais estavam distribuídas por 10 dos 169 genes presentes no painel genético virtual analisado. Os genes GNRHR, FGFR1, ANOS1 e CHD7 foram os mais frequentemente afetados. Notavelmente, a ampliação do painel genético não resultou num aumentou considerável da taxa de diagnóstico. No entanto, é importante destacar que este estudo expandiu o espectro mutacional da doença, identificando várias variantes até então nunca descritas. A maioria das variantes encontradas foi classificada como de significado indeterminado (VUS), mas a taxa de VUS não diferiu significativamente entre doentes e controlos, com exceção do gene EGF, onde foram encontradas VUS exclusivamente nos doentes. Concluímos que a maioria dessas variantes raras não estão diretamente relacionadas com o fenótipo estudado, refletindo provavelmente o fundo genético da população portuguesa. Em relação à oligogenia, observou-se uma frequência de 6,2% entre os doentes (5/81), um valor estatisticamente mais elevado quando comparado com os controlos. O estudo funcional de uma variante identificada no gene CHD7 (NM_017780.4: c.4354G>T, p.Val1452Leu), resultou no aumento da taxa de diagnóstico para 30,9%, demonstrando a importância dos estudos funcionais na reclassificação de VUS. Este trabalho enfatizou a complexidade genética do HHC, reforçando a importância de uma compreensão aprofundada da doença, seja para estabelecer o diagnóstico e/ou o prognóstico, para ajudar no aconselhamento genético e tratamento, seja para o esclarecimento dos processos biológicos, que potencialmente poderão contribuir para o desenvolvimento de terapias dirigidas no futuro.Pubertal development is a complex physiological process resulting from the interaction between the neuroendocrine system, genetic factors, and environmental influences. It begins with the reactivation of the Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis, leading to the production of gonadotropins, sex hormones, and the consequent development of secondary sexual characteristics. Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism (CHH) is a rare endocrine disorder that manifests during adolescence with a complete or partial absence of secondary sexual characteristic development. In adulthood, symptoms include lack of virilization and erectile dysfunction in males, primary amenorrhea in females, decreased libido, and infertility in both sexes. CHH is characterized by the absence or reduction in the production, secretion, or action of gonadotropin-releasing hormone. In 50 to 60% of cases, it is associated with anosmia/hyposmia (Kallmann Syndrome) or other congenital anomalies. The diagnosis of CHH is based on medical history, clinical signs, symptom assessment, and laboratory and imaging tests. However, since the early 21st century, the knowledge about the genetic causes of CHH has advanced alongside with the development of the genetic sequencing technologies. The availability of nextgeneration sequencing (NGS) has significantly improved the molecular diagnosis of these patients. This study aimed to investigate the genetic causes of CHH in Portuguese patients using NGS, in silico tools, and molecular biology techniques. A total of 81 patients with CHH and 263 Portuguese controls were studied. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and subjected to whole-exome sequencing. From the OMIM® and PubMed databases, 169 genes related to the CHH phenotype were identified and included in a virtual gene panel. Variants in these genes were filtered based on population frequency and genomic location and classified according to the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) and the Association for Molecular Pathology (AMP) criteria into five levels, ranging from benign to pathogenic. The minigene method was used to assess the impact of variants with potential to interfere in the splicing mechanism. The analysis of germline variants identified the genetic cause of CHH in 24 out of the 81 patients (29.6%). Causal variants were distributed across 10 of the 169 genes belonging to the virtual genetic panel, with GNRHR, FGFR1, ANOS1, and CHD7 being the most frequently affected genes. Notably, the expansion of the genetic panel did not significantly increase the diagnostic rate; however, this study broadened the mutational spectrum of the disease by identifying several previously undescribed variants. Most of the identified variants were classified as variants of uncertain significance (VUS), but the VUS rate did not significantly differ between patients and controls, except for the EGF gene, where VUS were found exclusively in patients. These findings suggest that most of these rare variants are not directly related to the studied phenotype, but rather reflect the genetic background of the Portuguese population. Regarding the oligogenic inheritance, a frequency of 6.2% was observed among patients (5/81), a statistically higher value compared to controls. The functional study of a variant identified in the CHD7 gene (NM_017780.4: c.4354G>T, p.Val1452Leu), increased the diagnostic rate to 30.9%, highlighting the importance of functional studies in reclassifying VUS. This work emphasized the genetic complexity of CHH, reinforcing the need for an indepth understanding of the disease to improve diagnosis, prognosis, genetic counseling, and treatment, as well as to clarify the biological processes that may contribute to the development of targeted therapies in the future.porEndocrinologiaFertilidadePuberdadeHipogonadismo Hipogonadotrófico CongénitoSíndrome de KallmannGenéticaSequenciação completa do exomaVariantesEstudos funcionaisEndocrinologyFertilityPubertyCongenital Hypogonadotropic HypogonadismKallmann syndromedoctoral thesis101681844