Alves, Marco Aurélio GouveiaOliveira, Carlos Pedro FontesSilva, Branca Maria Cardoso Monteiro daConde, Vanessa Raquel2018-08-012018-08-012014-10-302014-10-2http://hdl.handle.net/10400.6/5592O cancro da bexiga constitui uma das formas mais comuns de cancro. A maioria dos casos corresponde a tumores superficiais papilares, mas existe a possibilidade de estes evoluírem para um fenótipo muito mais agressivo e potencialmente fatal. É sabido que o metabolismo cancerígeno está intrinsecamente relacionado com elevado fluxo glicolítico, um fenómeno conhecido como efeito Warburg. Mesmo na presença de quantidades de oxigénio suficientes para realizar o processo de fosforilação oxidativa mitocondrial, estas células utilizam a glucose como principal fonte de energia, e exportam grandes quantidades de lactato. Deste modo, o estudo do metabolismo das células cancerígenas da bexiga e a forma como se associa com a progressão para estadios mais agressivos é fundamental para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico e estratégias terapêuticas. Por outro lado, sabe-se que esta doença é influenciada por factores dietéticos, de entre quais o consumo de chá tem sido destacado em vários estudos. O chá, uma bebida obtida através da infusão de folhas de Camellia sinensis, é amplamente conhecido pelas suas propriedades anticancerígenas. De facto, vários estudos reportaram que o extrato de chá verde e alguns dos seus componentes podem causar apoptose, interrupções no ciclo celular e modular vias de sinalização específicas em células cancerígenas da bexiga. Foi também demonstrado que a ação destes componentes pode resultar na inibição da metastização e dos processos angiogénicos tumorais. Pensa-se que o chá branco, apesar de não estar tão estudado, possa possuir propriedades anticancerígenas mais intensas que os outros tipos de chá. O primeiro objetivo deste trabalho foi analisar o metabolismo glicolítico de duas linhas celulares humanas de cancro da bexiga, representativas de diferentes estadios de progressão do cancro: RT4, representativas de um estadio primitivo, e TCCSUP, representativas de um estadio altamente invasivo. Com este propósito, foi estabelecido o perfil glicolítico das duas linhas celulares. Para tal, o meio extracelular foi analisado através de Ressonância Magnética Nuclear e os níveis de glucose, piruvato, alanina e lactato produzidos foram quantificados. Procedeu-se ainda à análise das expressões dos transportadores de glucose 1 e 3 (GLUT1 e GLUT3), do transportador de monocarboxilato 4 (MCT4) e das enzimas fosfofrutocinase 1 (PFK), glutamato-piruvato transaminase (GPT) e lactato desidrogenase (LDH) através da técnica de Western Blot. Com este estudo pretende-se contribuir para a identificação dos alvos moleculares terapêuticos para evitar ou contrariar a progressão do cancro da bexiga. Os nossos resultados demonstraram que, apesar de os níveis de consumo de glucose terem sido semelhantes em ambas as linhas celulares, os níveis de GLUT1, PFK e GPT estavam severamente reduzidos nas células TCCSUP, que representam um estadio altamente invasivo de cancro da bexiga. Além disso, estas células consumiam grandes quantidades de piruvato, levando à produção de grandes quantidades de lactato e alanina. O segundo objetivo deste trabalho consistiu no estudo preliminar dos efeitos de diferentes concentrações de extrato aquoso de chá branco na sobrevivência e no perfil glicolítico de ambas as linhas celulares, de forma a obter novas perspetivas acerca dos mecanismos através dos quais o chá branco exibe os seus efeitos anticancerígenos. Pretende-se, por fim, possibilitar o desenvolvimento de novos suplementos alimentares ou farmacêuticos para combater o cancro da bexiga. Deste modo, as células foram tratadas com diferentes concentrações de extrato aquoso de chá branco durante 48 horas. Os efeitos citotóxicos do extrato de chá branco foram avaliados através de um ensaio com sulforrodamina B. Depois de identificadas as concentrações de mais apropriadas para o estudo, as células foram tratadas com essas concentrações durante 24 horas. As expressões de GLUT1, MCT4, PFK e LDH foram determinadas através de Western Blot. Os estudos acerca da citotoxicidade revelaram que as concentrações de 0.25 mg/ml e 1 mg/ml de extrato induziram significativa morte celular no estadio mais primitivo de cancro da bexiga, representado pelas células RT4, mas a indução de morte celular significativa nas células TCCSUP foi atingida apenas com a concentração de 1 mg/ml. De notar, os níveis de expressão do GLUT1, PFK, LDH e MCT4 não foram significativamente alterados com o tratamento em nenhuma das linhas celulares. Os nossos resultados demonstram que a progressão do cancro da bexiga está associada a diversas alterações no metabolismo das células, particularmente no consumo de piruvato. Para além disso, verificámos que o consumo de glucose não é alterado na progressão de um estadio primitivo para um estadio altamente invasivo no cancro da bexiga, mas são produzidos níveis significativamente elevados de lactato e alanina, indicativos de um metabolismo mais acelerado. Estes factores podem indicar de que forma as células cancerígenas da bexiga respondem a ambientes agressivos, como estados de hipoxia. Além disso, os estudos de citotoxicidade revelaram que, apesar de o extrato de chá branco ser capaz de induzir morte celular em ambos os estadios de cancro da bexiga, é necessária uma concentração mais elevada para induzir a morte celular no estadio mais agressivo; isto sugere que as células de diferentes estadios de cancro da bexiga podem apresentar diferenças em termos de mecanismos de sobrevivência e/ou proliferação. Os nossos resultados preliminares indicam que esta indução de morte celular pelo extrato de chá branco não parece estar associada a alterações nos níveis de expressão de transportadores ou enzimas relacionadas com o processo glicolítico, mas são necessários mais estudos para comprovar estes resultados. Este trabalho demonstra que existem alterações metabólicas significativas na via glicolítica das células cancerígenas da bexiga, à medida que o cancro progride, e que o metabolismo do piruvato tem um papel preponderante. Estes resultados fornecem evidências importantes de que o metabolismo, particularmente um shift do consumo de glucose para piruvato, está envolvido na progressão de um estadio primitivo para altamente invasivo no cancro de bexiga. Foi ainda demonstrado que o chá branco é capaz de induzir a morte celular tanto em estadios primitivos da doença como em estadios mais avançados, embora neste último as concentrações de chá branco necessárias sejam mais elevadas. Estes são factos importantes para o futuro desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o cancro da bexiga.Bladder cancer is among the most common types of cancer and it can appear under different forms, being the transitional-cell carcinoma the most usual. The majority of the bladder cancer cases are superficial, low-grade tumors, but they may evolve to more aggressive and potentially fatal tumors. Cancer metabolism is intrinsically related to high glycolytic flux, a phenomenon known as the Warburg effect. Even in the presence of enough oxygen to sustain oxidative phosphorylation, these cells prefer to use glucose as main energy source, resulting in the export of very high levels of lactate. Knowledge of bladder cancer cells metabolism and how it is associated with progression to different and more aggressive states is still lacking and may help to develop new therapeutic approaches. Bladder cancer development is thought to be influenced by dietary factors, from which tea consumption has been highlighted. Tea is a beverage obtained from the infusion of the leaves or buds of the Camellia sinensis and is widely known for its anticancer properties. Particularly in bladder cancer, several studies reported that green tea extract and some of its components may cause cell apoptosis, cell cycle arrest, modulate cell specific pathways and inhibit metastization processes. White tea (WT), although not as well studied as the other types of tea, is thought to possess the highest anticancer properties among all types. Herein we propose to study the glycolytic metabolism of two human urinary bladder cancer cell lines, representative of different cancer progression stages: RT4 (primitive stage) and TCCSUP (highly invasive stage). With these purpose, we established the glycolytic profile of the two human bladder cancer cell lines. Therefore, levels of glucose, pyruvate, alanine and lactate in extracellular media were measured by Proton Nuclear Magnetic Resonance. The expression of glucose transporters 1 and 3 (GLUT1 and GLUT3), monocarboxylate transporter 4 (MCT4), phosphofructokinase 1 (PFK), glutamic-pyruvate transaminase (GPT) and lactate dehydrogenase (LDH) was determined by Western blot. This may help to identify a molecular pharmacological/therapeutic target to counteract or avoid the progression of bladder cancer. Our results demonstrate that although glucose consumption levels were similar in both cell lines, the levels of GLUT1, PFK and GPT were severely reduced in the TCCSUP cell line, representative of the highly invasive cancer stage. Moreover, these cells consumed high quantities of pyruvate, yielding elevated amounts of lactate and alanine. We also propose to conduct preliminary studies on the effects of different WT extract concentrations on the survival and glycolytic profile of both cancer cell lines. This may yield new insights on the mechanisms through which WT exhibits its anticancer effects, raising hypothesis about its use, or of any of its components, in anticancer food supplements or drugs. For citotoxity studies, the cells were treated with different concentrations of WT extract during 48 hours. WT induced cytotoxicity was evaluated through a sulforhodamine B assay. After selecting two suitable WT extract concentrations, the cells were treated for 24 hours. The expression of GLUT1, MCT4, PFK and LDH was determined. Studies on WT cytotoxicity revealed that 0.25 mg/ml and 1 mg/ml of WT extract successfully induced cell death in the primitive cancer stage, represented by the RT4 cell line, but cell death induction on TCCSUP cell line was only achieved by 1 mg/ml WT extract. Moreover, expression levels of GLUT1, PFK, LDH and MCT4 were not significantly altered by the treatment with WT extract on RT4 or TCCSUP cell lines. Our work demonstrates that bladder cancer progression includes several alterations in the cells’ metabolism, from which pyruvate consumption seems to be a major factor. Also, compelling evidence is provided that glucose uptake is not altered and higher levels of alanine and lactate are produced, which are indicators of a more accelerated metabolism, and may indicate how bladder cancer cells respond to aggressive environments such as hypoxia. Moreover, our cytotoxicity studies revealed that, although WT extract is capable of inducing cell death in both stages of bladder cancer, a higher concentration of WT extract is necessary to achieve cell death in the highly invasive stage than in the primitive stage. These results illustrate that cells in different cancer stages may present differences in their survival and/or proliferative mechanisms. Our preliminary results suggest that this cell death induction by WT extract does not seem to be accompanied by alterations in the protein expression levels of glucose transporters or enzymes related to the glycolytic process, but more studies are needed to clarify these results. Nonetheless, our work clearly demonstrates the metabolic alterations that occur in the glycolytic machinery of bladder cancer cells, as the cancer progresses. Moreover, WT successfully induces cell death in primitive and more advanced bladder cancer stages. This provides important new insights on cancer metabolism and evidence regarding WT anticancer properties, both extremely important for the future development of new therapeutic strategies for bladder cancer.porCamellia SinensisCancro da BexigaChá Branco.Efeito WarburgRt4Tccsupmaster thesis201292858