Cabral, Ana Cristina Mendes DiasCruz, CarlaRouqueiro, Rodrigo Anselmo2021-12-232021-12-232021-02-182020-12-23http://hdl.handle.net/10400.6/11494Protein A affinity chromatography has been the most used purification method for therapeutic antibodies in industrial processes, once it selectively purifies exploring molecular recognition and is an easy methodology. However, this type of chromatography has some costassociated drawbacks and upstream titer limitations. This, coupled to the demand for high purity and quality requirements from regulatory agencies and to the increasingly growth of monoclonal antibodies importance in therapeutic market, led to some work with the purpose of getting a better performance of engineered protein A ligands. Nowadays, derivate from the wild type Staphylococcal protein A (with five different antibody-binding domains, A, B, C, D, E), engineered variants are present in the market. All the domains consist in three a-helices, which bind to the CH2 region in the Fc part of the antibody and one of the most popular engineered variants is the tetrameric Z form, a mutant from the B-domain. The present work is part of a major aim where we intent to develop a Protein A monolithic column that shows better performance for the capture of antibodies from cell culture supernatant. Thus, two different main goals are studied: the thermodynamic evaluation of matrix properties (2,5% QA monolith) by analyzing its response to the adsorption of a model protein (Bovine serum albumin (BSA)); and the capacity assessment of an engineered ligand for antibody capture. The first goal was achieved using a Flow Microcalorimeter (FMC) and it is subdivided in two parts: first, multiple injections of different volumes with the same BSA concentration were performed submitting the column to different protein surface concentrations; and later, multiple consecutive injections were performed to understand what happens under overloading conditions and to observe the point at which the monolith stops to adsorb. The second aim is subdivided in three different objectives: interaction study of protein A novel ligand, presenting eight binding domains, with an IgG antibody; optimization of different ligand immobilization procedures; and comparison of the novel ligand with the commercial already existent engineered Z form (four domains, MabSelect SuRe), in terms of antibody isolation potential. Two prototypes variants of the novel ligand with 8 B binding domains were used. One of them is marked with a poly-histidine tag (B8(RH4)) and the other is tagged with cysteine-lysine-cysteine-lysine tail (B8 cys-lys-cys-lys). These two are thought, as previously mentioned, to be used primarily in protein A chromatography, namely in the direct capture of monoclonal antibodies due to the high specificity of the antibody-protein A bind.Com um peso molecular de aproximadamente 54 kDa a proteína A de origem estafilocócica, tal como o nome indica, é um domínio proteico exposto na superfície da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus. Esta proteína contém cinco domínios homólogos com capacidade de ligação a IgG, designados E, D, A, B e C, respetivamente, começando no grupo terminal amina. Para além desta região constituída por cinco domínios, fazem parte da sua estrutura outras duas regiões: a que liga à parede celular (XM) e a sequência sinal que é acionada na secreção (S). É frequentemente usada como ligando na cromatografia de afinidade, o tipo de cromatografia mais seletivo usado na Biotecnologia, que adicionalmente é a primeira escolha na maioria dos processos industriais. Este tipo de separação é baseado na interação reversível entre a proteína A, covalentemente ligada à matriz, e a biomolécula a ser capturada, no presente estudo um anticorpo policlonal (IgG). Nas primeiras abordagens em que se aplicaram este tipo de resinas, foram utilizadas formas nativas de Proteína A. Como forma de contornar algumas nuances relacionadas com o uso destas formas nativas, foram introduzidas algumas melhorias, nomeadamente: a possibilidade de trabalhar num largo intervalo de pH (2-11), o aumento da estabilidade conformacional do ligando, a compatibilidade com agentes redutores de limpeza e capacidade de conseguir altas taxas de recuperação (>95%) com alto nível de pureza 99%. Sendo a última vantagem um ponto fulcral, uma vez que os produtos purificados devem apresentar os níveis de purificação estabelecidos por entidades reguladoras, como a Agência europeia do medicamento (EMA) e a Organização mundial da saúde (OMS). Assim, dependendo do principal propósito ao qual o produto será aplicado, diferentes níveis de pureza são exigidos, tendo os produtos usados em extratos de crude o menor valor de pureza, e os biofármacos o maior, onde a pureza seguida da homogeneidade são parâmetros críticos para a segurança do paciente ao qual serão administrados. No presente trabalho, o produto alvo foi o anticorpo, acima mencionado. Anticorpos, são glicoproteínas com aproximadamente 150 kDa de tamanho. Estas moléculas pertencem à superfamília das imunoglobulinas (Ig), a sua principal função é a identificação e neutralização de organismos externos ou antigénios e são secretados pelas células B, que por sua vez são células sanguíneas brancas denominadas linfócitos B. A maior parte dos anticorpos encontrados no soro, pertencem à classe das IgG e a maioria da informação existente é também relativa a esta classe. A estrutura dos anticorpos consiste em três grandes fragmentos; dois deles são fragmentos que se ligam a antigénios (FAb) e cada um tem apenas um único local de ligação para o alvo específico; o terceiro e último fragmento, não liga a antigénios, porém parte dele é uma região cristalizável bastante importante (Fc). Adicionalmente, cada anticorpo é formado por 4 polipéptidos, dois deles de cadeia leve (com cerca de 25 kDa cada) e os outros dois de cadeia pesada (com 50 kDa cada). Estas cadeias são por sua vez ligadas entre elas, por pontes dissulfeto e juntas conferem a famosa forma de “Y” em que os braços são os FAb e o tronco o domínio Fc. Foi já demonstrado que os anticorpos são uma solução chave e a abordagem terapêutica para um largo espectro de doenças e condições médicas. Anticorpos e seus derivados têm vindo a ganhar cada vez mais atenção no campo biofarmacêutico e presentemente existem diversos novos produtos terapêuticos baseados em anticorpos monoclonais humanos à espera de serem aprovados. É importante realçar que o geral envelhecimento da população e a melhoria de vida nos mercados emergentes, também ajudaram na expansão farmacêutica global aumentando as vendas de anticorpos monoclonais. Assim, uma maior necessidade de produto levou consequentemente a uma necessidade de técnicas de produção e purificação mais eficientes. No entanto, o aumento da produção de biomoléculas terapêuticas não tem vindo a ser acompanhada pelo desenvolvimento dos processos de “downstream”, que são a parte mais dispendiosa do sistema de produção. A redução de custos implica aumentar o rácio final do produto por unidade de tempo (ou seja, o rendimento global), sendo a forma mais comum de conseguir este aumento de escala de operação, a utilização de colunas cromatográficas maiores ou aumentar a capacidade de purificação da fase estacionária, pela otimização das suas propriedades físico químicas. Posto isto, e dado que a formação do complexo IgG – proteína A tem um impacto importante no processamento das etapas de “downstream”, nomeadamente na captura e purificação de anticorpos, devido à alta seletividade da ligação, o que pode levar à eliminação de impurezas com rendimentos superiores a 95% em apenas um passo, a intenção final deste trabalho é desenvolver uma coluna monolítica de proteína A integrando um novo ligando em que se pretende ter uma melhor performance na captura de anticorpos do sobrenadante celular. Reduzindo deste modo os custos de “downstream” e melhorarando o processo. No presente estudo o nosso esforço focou-se em dois objetivos principais: a avaliação termodinâmica das propriedades da matriz, mais especificamente de um monólito 2,5% QA, analisando a resposta deste à adsorção de uma proteína modelo (Albumina de soro bovino - BSA); e avaliação da capacidade de um novo ligando projetado para a captura de anticorpos. O primeiro objetivo foi alcançado usando um Microcalorímetro de Fluxo (FMC), múltiplas injeções com diferentes volumes e com a mesma concentração de BSA foram efetuadas. Isto levou a que dependendo do “loop”, a coluna fosse submetida a diferentes concentrações de proteína à superfície, resultando em diferentes respostas. Foram ainda realizadas injeções consecutivas de maneira a se perceber o que aconteceria em condições de sobrecarga e a avaliar em que ponto o monólito atingiria a saturação. Como já referido foi utilizada na análise calorimetria de fluxo, uma vez que esta permite perceber melhor os mecanismos cinéticos e as forças motrizes envolvidas no processo de interação entre as biomoléculas e os suportes cromatográficos. Por sua vez, o segundo objetivo, é subdividido em três objetivos distintos; o estudo da interação do novo ligando de proteína A, que contém oito domínios de ligação, com o anticorpo IgG; otimização de diferentes procedimentos para a imobilização do referido ligando; e comparação do novo ligando de proteína A com o já existente MabSelect SuRe comercializado pela Merck (quatro domínios de ligação) em termos de potencial de isolamento do anticorpo IgG. Foram utilizadas duas variantes do protótipo do novo ligando: um marcado com uma cauda de poli-histidina (B8 (RH4)) e o outro marcado com uma cauda de cisteínalisina-cisteína-lisina (B8 cys-lys-cys-lys). Estes estudos, foram realizados num biossensor baseado em ressonância de plasmões de superfície (Biacore T200), que oferece diferentes tipos de chips permitindo a utilização de diferentes abordagens na captura dos ligandos.engAnticorposCapturaMicrocalorimetria de FluxoNovos LigandosProteína ARessonância Plasmónica de Superfíciemaster thesis202832287