Passarinha, Luís António PaulinoSousa, Ângela Maria Almeida deFerreira, Jorge Daniel BarrocaSilva, João Pedro Batista da2023-02-102023-10-092022-11-232022-10-10http://hdl.handle.net/10400.6/12901Prostate cancer is one of the most frequent cancers diagnosed in males, predicted to become the most prevalent malignancy in upcoming years. Current therapies have limited efficacy and are not suitable to mitigate the alarming incidence and mortality rates, especially in later hormone-refractory stages. In this manner, it is crucial the development of novel approaches. Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1 (STEAP1) is a protein highly overexpressed in PCa predicted to function as a transmembrane transporter and ionic channel, to play a role in intercellular communication between tumor cells and has been associated with the generation and propagation of high levels of reactive oxygen species. Consequently, STEAP1 leads to increased cellular proliferation and tumor aggressiveness. Furthermore, STEAP1 is mostly absent from normal tissues, suggesting a specificity for the cancer microenvironment, indicating that STEAP1 could have potential as a biomarker and therapeutic target. However, to explore this potential it is first necessary to isolate stable, bioactive and pure protein fractions of high concentration. Thus, we prepared calciumand nickel-crosslinked gellan gum microspheres through a water-in-oil emulsion with 1.41% (w/v) gellan at 750 rpm and 100ºC. The microspheres were characterized trough FTIR, SEM and EDX, ensuring adequate size, morphology, and crosslinking. The microspheres were used to capture STEAP1 solubilized in 0.1% (v/v) DM derived from Komagataella pastoris X33 Mut+ mini-bioreactor lysates using two different approaches, exploring ionic and affinity interactions. The ionic strategy presented the best results and consisted of STEAP1 capture in 10 mM MES buffer at pH 6.2. The target was then eluted by electrostatic repulsion with 10 mM Tris supplemented with 500 mM NaCl at pH 11. These optimized conditions allowed the recovery of STEAP1 in a single step, eliminating heterologous proteins in intermediary steps. The clarified fraction was polished by coupling with a Co-immunoprecipitation step. This technique was able to decomplex STEAP1-gellan gum complexes formed during the batch clarification. This innovative integration results in a monomeric STEAP1 fraction with high purity degree.O cancro da próstata é um dos cancros mais frequentemente diagnosticados no sexo masculino, prevendo tornar-se a neoplasia maligna mais prevalente nos próximos anos. As terapias atuais têm eficácia limitada e não são suficientemente adequadas para mitigar as alarmantes taxas de incidência e mortalidade (aproximadamente 1.4 e 0.38 milhões, respetivamente) especialmente em fases mais avançadas não responsivas a tratamento hormonal. Desta forma, é crucial o desenvolvimento de novas abordagens de diagnóstico e terapêuticas. A Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1 (STEAP1) é uma proteína sobre-expressa no cancro da próstata, funcionando como um transportador transmembranar e canal iónico e desempenhando um papel na comunicação intercelular entre células tumorais. Adicionalmente, esta proteína foi associada com elevados níveis celulares de espécies reativas de oxigénio. Consequentemente, a sobre-expressão de STEAP1 leva ao aumento da proliferação celular e agressividade do tumor. Além disso, a STEAP1 está maioritariamente ausente em tecidos normais e órgãos vitais, sugerindo uma especificidade para o microambiente tumoral, indicando que esta proteína membranar pode ser considerada um potencial biomarcador e alvo terapêutico. No entanto, para explorar esse potencial, é necessário isolar frações de STEAP1 estáveis, bioativas e puras em concentrações elevadas. Atualmente, a principal limitação dos bioprocessos de natureza recombinante está relacionada com a fase de downstream, sendo que estas etapas contabilizam aproximadamente 80% dos custos totais. As etapas cromatográficas efetuadas em modo sequencial na purificação de STEAP1 não produzem rendimentos apropriados para a cristalização desta proteína e consequentemente promover a determinação da estrutura 3D e o desenvolvimento estudos de biointeração com antagonistas emergentes. Assim, o método batch surge como uma alternativa, considerando que é um método largamente aplicado na indústria, sendo capaz de combinar as etapas de clarificação, concentração e purificação primária de proteínas numa única etapa. Paralelamente, este método é simples, rápido e de baixo custo. A goma gelana é um exopolissacarídeo aniónico que tem a capacidade de formar géis termorreversíveis na presença de catiões divalentes. Desde a sua descoberta, este polímero foi aplicado com sucesso na indústria alimentar, farmacêutica e biotecnológica. Recentemente, foi demonstrada a aplicabilidade da gelana como matriz cromatográfica, devido a ser um polímero poroso, hidrofílico e possuir elevada capacidade de ligação. Este conceito foi também aplicado na formulação de microesferas de gelana para a captura de proteínas solúveis e pDNA. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver e otimizar um método de batch utilizando microesferas de gelana para a captura de STEAP1, uma proteína transmembranar, diretamente de um lisado bruto de Komagataella pastoris X33 Mut+. Para atingir este objetivo, as microesferas de gelana foram preparadas através do método de emulsão água-em-óleo pela extrusão de uma solução de 1.41% de gelana previamente aquecida a 90ºC sobre uma solução de óleo a 750 rpm e 100ºC. As microesferas foram reticuladas com cálcio e níquel, correspondendo aos tipos de estratégias iónica e de afinidade exploradas no batch, respetivamente. As microesferas foram caracterizadas relativamente ao diâmetro médio (microscopia semiótica), à morfologia (SEM) e composição química (FTIR e EDX). Os resultados obtidos demonstram que as microesferas apresentam uma morfologia esférica com uma estrutura uniforme e consistente, com tamanhos médio de 239.06 µm (níquel) e 330.37 µm (cálcio). O EDX demonstrou uma maior percentagem de integração de níquel, quando comparado com microesferas de gelana reticuladas com cálcio, justificando o menor tamanho destas microesferas pela formação de uma rede tridimensional mais compacta. Os espectros de FTIR juntamente com as percentagens iónicas obtidas por EDX demonstram o sucesso da etapa de reticulação. Em relação ao batch, várias otimizações foram realizadas visto que a STEAP1 apresentou alguma tendência de formar complexos estáveis com a gelana. Inicialmente, foi demonstrado que o detergente DM, a uma concentração de 0.1% (v/v), permitiu a solubilização mais eficaz e, por conseguinte, maior grau de recuperação de STEAP1. Posteriormente, a concentração ideal de lisado a injetar na matriz de gelana, correspondeu a ~7 mg de proteína total/mL, ou seja, uma diluição de 1:6 (concentração de lisado bruto de ~43 mg/mL) por cada produção de batch. Por último, verificou-se que 35 mL de microesferas de gelana para 6 mL de tampão é o rácio ideal a utilizar no método de captura em modo batch. As microesferas reticuladas com níquel foram utilizadas para a estratégia de afinidade. Surpreendentemente, a pH 9.2 foi possível ligar a totalidade de STEAP1 explorando a afinidade da sua cauda de histidinas aos iões de níquel presentes na superfície das microesferas de gelana. No entanto, no método de batch a STEAP1 provou ser sensível mesmo a modestas concentrações de imidazole e não foi possível recuperar a proteína alvo numa única fração. Contrariamente, as microesferas de cálcio utilizadas na estratégia iónica produziram resultados mais encorajadores. De facto, a STEAP1 liga totalmente a pH 6.2 em 10 mM MES e elui numa única fração na presença de 500 mM NaCl a pH 11 em 10 mM Tris. No entanto, não foi possível eliminar totalmente a formação de complexos STEAP1-gelana, mesmo com a implementação de várias etapas de otimização, nomeadamente, solubilização, concentração de lisado, rácio de microesferas e nas etapas do batch, bem como das suas respetivas concentrações de NaCl. Para descomplexar a STEAP1 da gelana, as frações recuperadas do batch iónico foram acopladas a uma etapa de polimento de co-imunoprecipitação, descomplexando os agregados STEAP1-gelana que resultaram numa fração de STEAP1 na forma monomérica (~35 kDa) de elevado grau de pureza. Desta forma, demonstramos uma integração inovativa baseada no método de batch de gelana com uma etapa de coimunoprecipitação que resulta na captura, clarificação e purificação de STEAP1.engSteap1Cancro da PróstataClarificaçãoCo-ImunoprecipitaçãoGelanaMétodo de Batchmaster thesis203219830