Almeida, Paulo Jorge da SilvaTomaz, Cândida Ascensão TeixeiraBrito, Andreia Sofia Costa2018-09-042018-09-042015-11-122015-10-5http://hdl.handle.net/10400.6/6105A cromatografia é uma poderosa ferramenta preparativa e analítica e um dos métodos de purificação mais importantes aplicados em processos “downstream” no ramo da Biotecnologia. A cromatografia de afinidade é uma das técnicas de eleição na purificação de DNA plasmídico (pDNA), sendo o ligando usado um dos fatores principais para o sucesso do processo. A purificação cromatográfica de pDNA requer suportes altamente porosos devido ao seu alto peso molecular e à elevada viscosidade das suas soluções. Os criogéis são materiais poliméricos macroporosos com canais interconectados, sendo uma alternativa aos suportes particulados convencionais na purificação de pDNA. O 3,8-diamino-6-fenilfenantridina (DAPP) e o tosilato de 5-pent-4-en-1-il-fenantridínio são ligandos de origem sintética e apresentam na sua estrutura um braço espaçador e carga positiva, o que os torna potencialmente adequados para a imobilização num criogel usando e o metacrilado de 2-hidroxietilo (HEMA) como co-monómero, para posteriores estudos cromatográficos. Neste projeto, foram testados dois métodos de imobilização do ligando à matriz e dois suportes de controlo. Foram efetuados vários ensaios cromatográficos, de retenção e de separação das isoformas superenrolada (sc) e circular aberta (oc) de pDNA. Adicionalmente, testou-se a separação da isoforma sc a partir de uma amostra de lisado clarificado. Os resultados mostram que o DAPP (5 mg/mL) e o HEMA são os ligandos com melhores perfis de retenção sendo por isso escolhidos para os estudos de separação de isoformas. Tanto o DAPP como o HEMA mostraram seletividade para a isoforma sc usando como passo de ligação uma solução tampão de acetato de sódio 10 mM pH 5,0 e como passo de eluição, tampão acetato de sódio 10 mM pH 5,0 na presença de NaCl. Quanto à amostra de lisado clarificado, apenas o HEMA revelou capacidade de separação da isoforma sc dos contaminantes RNA e proteínas. Estes estudos iniciais permitiram demonstrar o potencial da aplicabilidade de criogéis com ligandos sintéticos para a separação e purificação de pDNA por cromatografia de afinidade.Chromatography is a powerful analytical and preparative tool and one of the major methods applied in downstream purification processes in the biotechnology field. Affinity chromatography is one of the techniques of choice in purification processes of plasmid DNA (pDNA) and the ligands are the main factor for a successful process. Purification of pDNA requires highly porous matrices due to their high molecular weight and high viscosity of the solutions. The cryogels are macroporous polymeric materials with interconnected channels becoming an alternative to the conventional particulate supports in the purification of pDNA. The 3,8-Diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP), tosylate 5-(pent-4 -en-yl)phenanthridinium and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) are synthetic ligands with an easy synthesis that present in their structure one spacer arm and positive charge which made them potentially suitable ligands for immobilization onto to a cryogel and subsequent chromatographic studies. In this study two immobilization methods of ligand to the matrix and two control supports were studied. Several chromatographic experiments were carried out: initially, the retention, and separation of supercoiled (sc) isoform from open circular (oc) isoform in a sample of concentrated pDNA and then separation of sc isoforms from impurities in a sample of clarified lysate. The results showed that DAPP 5 (mg/mL) and HEMA have the best retention profiles being chosen for the isoforms separation studies. Both DAPP and HEMA showed selectivity for the sc isoform using 10 mM sodium acetate buffer pH 5, as binding step, and two step elution with a 10 mM sodium acetate buffer pH 5 in the presence NaCl. Only HEMA showed ability to separate sc isoform from impurities such as RNA and proteins in the clarified lysate sample. These initial studies have demonstrated the potential applicability of cryogels with synthetic ligands to pDNA separation and purification by affinity chromatography.porCriogéisCromatografia de AfinidadeDappDna PlasmídicoFenantridinasHemaPurificaçãomaster thesis201644657