Socorro, Sílvia Cristina da Cruz MarquesFigueira, Marília Isabel Neto2024-02-092025-01-312023-12-20http://hdl.handle.net/10400.6/14240Prostate cancer (PCa) is the second most frequent type of cancer among men, with an increasing incidence worldwide. PCa is highly regulated by hormones, with androgens playing a crucial role in its development and progression. However, also estrogens are accepted to influence PCa. In fact, estrogens were used in PCa treatment for decades, after the pioneer work of Huggins and Hodges demonstrating that PCa is a hormone-sensitive cancer, stimulated by androgenic activity and inhibited by suppression of androgens levels or estrogens administration. Nevertheless, despite the effectiveness of estrogens administration in delaying the progression of metastatic PCa, this therapy was discontinued because of the adverse side effects. Over the years, a vast number of studies were performed with the aim of deciphering the role of estrogens in PCa and find new estrogen-based alternatives for PCa treatment without the adverse effects. However, a contradiction in the estrogens actions remains evident in the literature until now. Many studies have pointed out estrogens as causative agents of PCa, contributing to its development and progression. Though, also a panoply of reports defended estrogens as protective against PCa, suppressing tumor growth, inducing apoptosis and inhibiting metastization, in line with their efficacy as therapeutic agents. This dual activity was associated with the diversity of receptors activated by estrogens, with the pro-carcinogenic actions associated with the activation of the estrogen receptor α (ERα), whereas anti-carcinogenic effects are linked to ERβ activation. Moreover, the discovery of G protein-coupled estrogen receptor (GPER) increased the complexity of mechanisms orchestrating estrogens actions. GPER is a membrane-bound ER that mediates the rapid, non-genomic effects of estrogens by mobilizing intracellular calcium and activating several signaling pathways. A substantial amount of evidence in different cancer types has been describing the anti-tumorigenic effects of GPER suppressing tumor growth and progression. A research area with increasing interest is the determination of the anti-carcinogenic actions of phytoestrogens, strengthened by the evidence of the lower incidence of PCa in Eastern countries, which typically have high consumption of these compounds in a consequence of plant-enriched diets. Furthermore, the mechanism of action of some of these compounds in PCa cells has been shown to require GPER activation. The present thesis aimed to answer some of the existent questions on the estrogens and GPER actions in PCa cells, which would lay the foundations for the development of new and safe estrogen-based therapies. First, it was investigated the action of estrogens as regulators of apoptosis and proliferation in prostate cells in the interplay with the SCF/c-KIT system, a set of ligand and receptor highly involved in carcinogenesis and a target of steroid hormones. Herein, it was demonstrated that E2 down-regulated the expression of the SCF/c-KIT system both in human PCa cell lines and rat prostate in vivo, which was accompanied by the effects of E2 suppressing proliferation and inducing apoptosis in rat prostates. These results supported the protective role of estrogens against PCa. Considering the promising results in other types of cancer, it was determined the effect of GPER activation in PCa cells covering several cancer hallmarks, from cell fate to metabolic reprogramming. It was found that GPER is highly expressed in PCa compared to benign prostatic hyperplasia (BPH) cases. Furthermore, GPER immunoreactivity was inversely correlated with PSA levels. GPER protein levels also were higher in neoplastic LNCaP cells than in the non-neoplastic PNT1A cells. Nevertheless, castrate-resistant PCa (CRPC) cells displayed reduced expression of GPER compared to the androgen-responsive cell line, supporting that GPER protein levels could be modulated by androgens. GPER was found to be localized at the cell membrane, endoplasmic reticulum and, residually, in the nucleus of prostate cells and this subcellular localization was altered by the GPER-specific agonist G1. G1-treatment showed a multiplicity of beneficial effects in PCa, targeting a panoply of cancer hallmarks. It reduced PCa cells viability and proliferation, arresting cell cycle and increasing apoptosis. It was also able to reduced migration and invasion, concomitantly with epithelial-mesenchymal transition (EMT) attenuation, depending on the cell line. Moreover, GPER activation by G1 increased energy metabolism and oxidative stress in PCa cells. Finally, it was evaluated how natural compounds, such as diosgenin, can influence the behavior of PCa in the interplay with GPER. Diosgenin diminished the viability of androgen-responsive and CRPC cells, without affecting the viability of non-neoplastic PNT1A cells. Moreover, the compound induced apoptosis and modulated glycolytic metabolism of PCa cells. The effects of diosgenin were enhanced when combined with G1, supported by the ability of diosgenin to augment the expression levels of GPER. Furthermore, GPER knockdown by a siRNA approach abrogated diosgenin effects inducing apoptosis of PCa cells, which implicates this receptor in the diosgenin mechanism of action. Globally, the findings of this thesis support the protective role of estrogens in PCa, disclosing new molecular targets and cellular processes. Moreover, it provides valuable information to find new therapeutic options, namely, estrogen-like, to deaccelerate the progression of disease and improve the survival of PCa patients.O cancro da próstata (CaP) é o segundo tipo de cancro mais comum entre os homens, com uma incidência crescente a nível mundial. É uma neoplasia altamente dependente da ação hormonal, tendo os androgénios um papel crucial no seu desenvolvimento e progressão. Contudo, também os estrogénios têm influência no cancro da próstata. De facto, os estrogénios foram usados no tratamento do CaP durante décadas, após os trabalhos pioneiros de Huggins e Hodges que demonstraram que o CaP é sensível à ação das hormonas, sendo estimulado pela ação dos androgénios e inibido pela supressão dos níveis de androgénios ou pela administração de estrogénios. No entanto, apesar da administração de estrogénios ser eficaz no atraso da progressão do CaP metastático, esta terapia foi descontinuada devido aos seus efeitos adversos colaterais. Ao longo dos anos, inúmeros estudos têm sido feitos com o objetivo de decifrar o papel dos estrogénios no CaP e de encontrar novas alternativas terapêuticas com base nos estrogénios, sem os efeitos adversos. Todavia, a contradição relativa à ação dos estrogénios continua a ser evidente na literatura até hoje. Muitos estudos apontam os estrogénios como agentes causadores de CaP, contribuindo para o seu desenvolvimento e progressão. Contudo, também há uma panóplia de estudos que defendem os estrogénios como protetores contra o CaP, suprimindo o crescimento tumoral, induzindo apoptose e inibindo a metastização, o que está de acordo com a sua eficácia como agentes terapêuticos. Esta atividade dual foi associada à diversidade de recetores ativados pelos estrogénios, estando os efeitos pro-carcinogénicos associados com a ativação do recetor de estrogénios α (ERα), enquanto que os efeitos anti-carcinogénicos têm sido atribuídos à ativação do ERβ. Além disso, a descoberta do recetor de estrogénios acoplado a proteína G (GPER) aumentou a complexidade dos mecanismos que orquestram as ações dos estrogénios. O GPER é um recetor de estrogénios membranar que intervém nos efeitos rápidos e não genómicos dos estrogénios, através da mobilização de cálcio intracelular e da ativação de várias vias de sinalização. Uma quantidade substancial de evidências descreve os efeitos anti-tumorigénicos do GPER, suprimindo o crescimento e progressão tumoral em diferentes tipos de cancro. Uma área de investigação com um crescente interesse está relacionada com o estudo dos efeitos anti-carcinogénicos dos fitoestrogénios, suportada pela evidência de que a incidência do CaP é mais baixa nos países orientais, nos quais tipicamente existe o consumo de elevadas quantidades destes compostos como consequência de uma dieta rica em plantas. Adicionalmente, tem sido demonstrado que os mecanismos de ação de alguns destes compostos requerem a ativação do GPER. A presente tese teve como objetivo responder a algumas das questões existentes sobre os estrogénios e as ações do GPER em células de CaP, permitindo estabelecer alicerces para o desenvolvimento de terapias baseadas em estrogénios novas e seguras. Primeiramente, foram investigadas as ações dos estrogénios como reguladores da apoptose e proliferação em células da próstata, e a sua interação com o sistema SCF/c-KIT, um conjunto de ligando e recetor altamente envolvido na carcinogénese e alvo de hormonas esteroides. Aqui, foi demonstrado que o 17β-estradiol (E2) reduziu a expressão do sistema SCF/c-KIT quer em linhas celulares humanas de CaP, quer em próstata de rato in vivo. Além disso o E2 mostrou efeitos na supressão da proliferação e na indução da apoptose n próstata de rato. Estes resultados suportam a ideia do papel protetor dos estrogénios contra o CaP. Considerando os resultados promissores noutros tipos de cancro, foi determinado o efeito da ativação do GPER em células de CaP, abrangendo vários “hallmarks” do cancro, desde a decisão do destino celular à reprogramação metabólica. Verificou-se que o GPER é altamente expresso em casos de CaP comparativamente a casos de hiperplasia benigna da próstata (BPH). Além disso, a imunoreatividade do GPER foi inversamente correlacionada com os níveis de antigénio prostático específico (PSA). Também se verificaram níveis de GPER mais altos nas células neoplásicas LNCaP do que nas células não neoplásicas PNT1A. No entanto, células de CaP resistente à castração (CRPC) mostraram ter expressão de GPER reduzida comparativamente à linha celular responsiva aos androgénios, suportando a ideia de que os níveis de proteína GPER podem ser alterados pelos androgénios, o que foi comprovado neste estudo. Verificou-se que o GPER estava localizado na membrana celular, no retículo endoplasmático e, residualmente, no núcleo as células da próstata, e que esta localização subcelular foi alterada pelo G1, agonista específico do GPER. O tratamento com G1 mostrou uma multiplicidade de efeitos benéficos no CaP, afetando uma panóplia de “hallmarks” do cancro. Este tratamento reduziu a viabilidade e proliferação das células de CaP, bloqueando o ciclo celular e aumentando a apoptose. Também se verificou a capacidade do G1 reduzir a migração e invasão, concomitantemente com a redução da transição epitelial-mesenquimal (EMT), dependendo da linha celular. Adicionalmente, a ativação do GPER pelo G1 aumentou o metabolismo energético e o stress oxidativo das células de CaP. Por último, avaliou-se como é que compostos naturais, como a diosgenina, podem influenciar o comportamento do CaP considerando a sua interação com o GPER. A diosgenina diminuiu a viabilidade das células responsivas a androgénios e das CRPC, sem afetar a viabilidade das células não neoplásicas PNT1A. Além disso, o composto induziu apoptose e alterou o metabolismo glicolítico das células de CaP. Os efeitos da diosgenina foram incrementados aquando do tratamento combinado com G1, suportado pela capacidade da diosgenina aumentar os níveis de expressão do GPER. Adicionalmente, o “knockdown” do gene GPER, através da tecnologia de siRNA suprimiu o aumento da apoptose causado pelo tratamento com diosgenina nas células e CaP, o que implica este recetor no mecanismo de atuação da diosgenina. No geral, as descobertas desta tese suportam o papel protetor dos estrogénios no CaP, revelando novos alvos moleculares e processos celulares. Além disso, estes resultados fornecem informação importante para se encontrar novas opções terapêuticas, nomeadamente, baseadas em estrogénios, para desacelerar a progressão da doença e melhorar a sobrevivência os doentes com CaP.engCancro da próstata - PCaEstrogéniosRecetor de estrogénios acoplado a proteína G - GPERDiosgeninaProstate cancerdoctoral thesis101762461