Cascalheira, José Francisco da SilvaEsteves , Blandina Isabel Oliveira2015-11-202015-11-202011http://hdl.handle.net/10400.6/3902O cérebro requer um fornecimento contínuo de oxigénio e glucose para manter a sua fun-ção. A actividade neuronal depende principalmente da disponibilidade de oxigénio, pelo que, re-quer o contínuo aprovisionamento de oxigénio e glucose. Dados experimentais e clínicos sugerem que a privação de oxigénio e/ou glucose (POG) altera a produção de energia no cérebro e gera radicais livres, que podem conduzir a morte neuronal. O acidente vascular cerebral (AVC) isqué-mico agudo é uma das principais causas de mortalidade e aproximadamente 80% dos AVC são causados por AVC isquémico. O cérebro é particularmente vulnerável à isquémia (POG), particu-larmente, o cérebro adulto. A lesão celular isquémica tem sido implicada na morte celular após vários tipos de cirurgia. Os procedimentos cirúrgicos, muitas vezes, envolvem a interrupção tempo-rária ou permanente do fornecimento de sangue às células ou tecidos e, assim, induzem dano celular isquémico. O fenómeno de pré-condicionamento a insultos neurotóxicos consiste no facto de a aplicação prévia de um insulto ligeiro, não neurotóxico, prevenir o dano causado por um insulto maior aplicado posteriormente. Estudos anteriores demonstraram que insultos subletais isquémicos podem pré-condicionar e, assim, proteger os tecidos, como coração e cérebro de insul-tos subsequentes (de maior intensidade). Estudos anteriores indicam que em culturas de fatias de cérebro, obtidas a partir de ratos recém nascidos, o efeito protector obtido por pré-condicionamento com um insulto isquémico ligei-ro (pré-condicionamento isquémico - IPC), é dependente da activação dos receptores A1 da adeno-sina (A1Rs). Por outro lado, agonistas dos A1R aplicados antes do insulto neurotóxico (pré-condicionamento químico - CPC), diminuem o dano celular causado por este em alguns modelos experimentais. No entanto, o efeito quer do pré-condicionamento isquémico quer do pré-condicionamento químico, com agonistas do A1R, em animais adultos não está esclarecido, apesar da resistência à isquémia ser menor em animais adultos. No presente trabalho, o efeito do pré-condicionamento a insultos isquémicos neurotóxicos, por aplicação de insultos isquémicos ligeiros foi comparado com o efeito do pré-condicionamento por aplicação de agonistas do A1Rs, em fatias recém preparadas de hipocampo de ratos adultos. O efeito neuroprotector do pré-condicionamento foi avaliado por quantificação da sobrevivência celular e da morte celular (apoptose/necrose). A quantificação da tolerância isquémica induzida foi investigada através de diferentes métodos, tais como: método do cloreto de 2,3,5- Trifenilte-trazólio (TTC) e avaliação da actividade da caspase-3. Com base na avaliação, por quantificação da sobrevivência celular (TTC), do efeito do pré-condicionamento a insultos isquémicos, por aplicação de insultos isquémicos ligeiros não neu-rotóxicos, observou-se que o pré-condicionamento com dois insultos isquémicos ligeiros (3 minutos de POG) face à aplicação de um insulto isquémico neurotóxico (20 minutos de POG) 3 horas depois, apresentava efeito neuroprotector (22,8% de aumento da sobrevivência neuronal). Em relação à avaliação, por quantificação da viabilidade celular (TTC), do efeito do pré-condicionamento químico a insultos isquémicos, por aplicação de agonistas do receptor A1 da ade-nosina, os resultados sugerem que o pré-condicionamento com CPA (10 M durante 20 minutos) poderá ter um efeito neuroprotector (7% de aumento de viabilidade celular) face à aplicação de um insulto isquémico severo (20 minutos de POG). Contudo, a neuroprotecção conferida pelos agonistas dos A1R é apreciavelmente inferior à conferida pelo pré-condicionamento isquémico (7% versus 22,8%). Desta forma, depreende-se que a tolerância isquémica induzida pelo IPC, embora possa ser dependente da activação dos A1Rs, no entanto, eles por si só, não são suficientes para reproduzir o efeito do IPC. Ou seja, a neuroprotecção conferida depende da activação de A1R como sendo parte integrante de um conjunto de vias necessárias para a constituição do processo de neuroprotecção, conferindo tolerância isquémica transitória ou prolongada. Relativamente à duração do efeito promovido pelo pré-condicionamento, não sabemos se se trata de um efeito momentâneo de curta duração (transitório) ou tardio (prolongado).The brain requires a continuous supply of oxygen and glucose to maintain their function. The neuronal activity depends mainly on the availability of oxygen, therefore, requires continuous supply of oxygen and glucose. Experimental and clinical data suggest that deprivation of oxygen and/ or glucose (OGD) alters the production of energy in the brain and generates free radicals, which can lead to neuronal death. The cerebral vascular accident (CVA) is an acute ischemic major cause of mortality and approximately 80% of strokes are caused by ischemic stroke. The brain is particularly vulnerable to ischaemia (OGD), particularly the adult brain. The cell damage has been implicated in ischemic cell death after various types of surgery. Surgical procedures often involve the temporary or permanent interruption of blood supply to cells or tissues and thereby induce ischemic cell damage. The phenomenon of preconditioning to neurotoxic insult consist in fact that the prior application of a mild insult, not neurotoxic, prevent the damage caused by a greater insult applied later. Previous studies have shown that sublethal ischemic insults may pre-condition and thereby protect tissues such as heart and brain to subsequent insults (highest intensity). Previous studies indicate that in cultured brain slices obtained from newborn rats, the protective effect obtained by preconditioning with a mild ischemic insult (ischemic preconditioning - IPC), is dependent on the activation of adenosine A1 receptor (A1R). Moreover, A1Rs agonists applied prior to neurotoxic insult (chemical preconditioning - CPC), reduce cell damage caused by the insult in some experimental models. However, the effect of either ischemic preconditioning or chemical preconditioning, with A1R agonist, in adult animals is unclear, despite the less resistance to ischemia in adult animals. In this study, the effect of preconditioning to ischemic neurotoxic insults by applying mild ischemic insults was compared with the effect of preconditioning by applying A1RS agonists in sliced freshly prepared adult rat hippocampus. The neuroprotective effect of preconditioning was assessed by quantification of cell survival and cell death (apoptosis / necrosis). The quantification of induced ischemic tolerance was investigated using different methods, such as method of the 2,3,5 - triphenyltetrazolium chloride (TTC) and assessment of caspase-3 activity. Studying by quantification of cell survival (TTC), the effect of preconditioning to ischemic insults, by applying mild ischemic non neurotoxic insults, it was observed that the preconditioning with two mild ischemic insults (3 minutes POG) showed neuroprotective effect (22.8% increase in neuronal survival) against the application of a severe ischemic insult (20 minutes OGD) 3 hours later. Studying by quantification of cell viability (TTC), the effect of chemical preconditioning to ischemic insults, by applying agonists of adenosine A1 receptor, the results suggest that preconditioning with CPA (10 M for 20 minutes) may have a neuroprotective effect (7% increase in cell viability) against the application of a severe ischemic insult (20 minutes OGD). However, the neuroprotection produced by A1R agonists is appreciably lower than that conferred by ischemic preconditioning (7% versus 22.8%). Thus, it appears that the ischemic tolerance induced by IPC, although it may be dependent on the activation of A1RS, however, are not sufficient alone to reproduce the effect of IPC. That is, the neuroprotection afforded depends on the activation of A1R as part of a set of pathways necessary to the process of neuroprotection, producing transient or prolonged ischemic tolerance. About the duration of the effect promoted by preconditioning, we do not know whether it is a momentary effect of short duration (transient) or late (prolonged).porIsquémia cerebralPré-condicionamento isquémico (IPC)NeuroprotecçãoAdenosina - Sistema nervosoReceptores de adenosina tipo A1master thesis