Santos, Adriana Oliveira dosVaz, Cátia Alexandra VicenteRocha, Sandra Catarina MoreiraRoque, Ana Catarina Santos2022-12-092022-12-092022-07-292022-06-28http://hdl.handle.net/10400.6/12487A ativação das GTPases Ral (RalA e RalB), pertencentes a uma subfamília de proteínas Ras, é efetuada por 6 fatores de troca de nucleótidos de guanina específicos de Ral (RalGEFs). RalGPS2 (Ral GEF with PH domain and SH3 binding motif 2) é um dos membros da família de RalGEFs cuja ativação é independente da sinalização por Ras. Resultados anteriores obtidos em linhas de cancro do pulmão e um ensaio de duplohíbrido em leveduras (Santos A.O. e Camonis J., não publicado) sugeriram a hipótese de que RalGPS2 teria um papel na regulação dos co-ativadores transcricionais da via Hippo YAP/TAZ. No presente trabalho, essa hipótese foi testada silenciando RalGPS2 em células de cancro da próstata e avaliando o crescimento, a sobrevivência e a expressão de genes induzidos pela ativação de YAP/TAZ. O silenciamento de RalGPS2 por siRNA foi otimizado em células de cancro da próstata PC-3, sendo o efeito na viabilidade/proliferação celular avaliado pelo ensaio de redução de resazurina aos 5 dias após a transfeção. A percentagem de indução espontânea de apoptose e a distribuição do ciclo celular foram obtidos por citometria de fluxo após marcação das células com iodeto de propídio. A expressão de mRNA dos genes regulados por YAP/TAZ, CTGF e CYR61, assim como de RalGPS2, foi obtida por PCR quantitativo em tempo real. Adicionalmente, foi explorado o efeito do silenciamento de RalGPS2 na expressão de CTGF e CYR61 em condições de estimulação com soro fetal bovino. O silenciamento de RalGPS2 inibiu o crescimento de PC-3 (˜ 59%) e aumentou a taxa de apoptose espontânea das células. A expressão de mRNA de RalGPS2 diminuiu significativamente tanto aos 3 quanto aos 5 dias após o silenciamento, no entanto, não se detetou a diminuição da expressão dos genes CTGF e CYR61. Em conclusão, o papel de RalGPS2 no controlo da proliferação e sobrevivência de células PC-3 não parece estar associado à ativação de YAP/TAZ induzida pelo soro nesta linha celular.The activation of GTPases RalA and RalB, a subfamily of Ras proteins, is done by 6 Ralspecific guanine nucleotide exchange factors (RalGEFs). RalGPS2 (Ral GEF with PH domain and SH3 binding motif 2) is one of the RalGEFs family members whose activation is independent from Ras signaling. Previous results obtained by the group in lung cancer cell lines and on a yeast two-hybrid screen (Santos A.O. e Camonis J., not published) raised the hypothesis that RalGPS2 may participate in the regulation of YAP/TAZ (transcriptional co-activators of the Hippo pathway). In the present work, this hypothesis was tested by silencing RalGPS2 in prostate cancer cells and evaluating growth, survival and the expression of genes induced by YAP/TAZ activation. The siRNA mediated RalGPS2 gene silencing was optimized in PC-3 human prostate cancer cell line, and the effect on the cell proliferation and viability assessed by a resazurin reduction assay 5 days after transfection. The percentage of spontaneous apoptosis induction and cell cycle distribution were obtained by propidium iodide cell staining and flow cytometry. The mRNA expression of two genes regulated by YAP/TAZ, CTGF and CYR61, as well as RalGPS2 mRNA expression was measured by quantitative real-time PCR. Additionally, the effect of RalGPS2 gene silencing on the mRNA expression of genes regulated by YAP/TAZ, in conditions of stimulation of activation of these co-transcription activators by fetal bovine serum, was explored. RalGPS2 silencing caused growth inhibition in PC-3 (˜ 59%), increased the percentage of spontaneous apoptotic cells. RalGPS2 mRNA expression decreased significantly both at 3 and 5 days after silencing, however, no decrease in expression of CTGF and CYR61 genes was detected. In conclusion, the role of RalGPS2 in controlling proliferation and survival of PC-3 cells does not appear to be associated with serum-induced YAP/TAZ activation in this cell line.porApoptoseCancro da PróstataPc-3ProliferaçãoRalgps2Yap/Tazmaster thesis203115317