Duarte, Ana Catarina AbreuSantos, Cecília Reis Alves dosCarreira, Maria Carolina Lareiro2025-11-212025-11-212025-07-07http://hdl.handle.net/10400.6/19351Brain tumors remain one of the most aggressive and lethal forms of cancer, posing significant challenges to treatment due to their critical location, infiltrative nature, and resistance to conventional therapies. One of the main factors limiting the effectiveness of treatment in brain tumors is the difficulty of chemotherapeutic agents reaching the central nervous system in adequate concentrations. Brain barriers, despite being essential for central nervous system protection and homeostasis, have a high selective nature that restricts the ability of chemotherapeutic agents to reach tumors, reducing the available therapeutic options. This restricted permeability is mostly mediated by the ABC transporter superfamily, which is expressed in both the blood-brain barrier and the blood–cerebrospinal fluid barrier and actively extrudes a wide variety of substances out of the brain, including many anticancer compounds. Taste receptors, traditionally associated with oral cavities, are also expressed in extraoral tissues, including the brain and many tumors. Lactisole, a well-known inhibitor of sweet taste receptors, affects cancer cell proliferation, possibly due to the high glucose dependency of these cells. Quercetin, a bitter compound that is a known ligand of TAS2R14, has demonstrated potential therapeutic effects by overcoming chemoresistance mechanisms and inducing apoptosis in cancer cells. This study aimed to investigate the permeability of the blood-brain and blood– cerebrospinal fluid barriers to lactisole and quercetin, and whether quercetin's interaction with TAS2R14 affects ABC transporter expression. For that a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) and a human cerebral microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3) were used to establish in vitro models that mimics the in vivo phenotypic characteristics of the blood–cerebrospinal fluid barrier and the blood-brain barrier, respectively. It was verified that lactisole did not reduce viability in the HIBCPP cell line but in hCMEC/D3 cells, a decrease in viability was observed. Through transepithelial electrical resistance measurements and immunocytochemistry, it was possible to optimize the blood-brain barrier model. The 6th day of culture proved to be the most appropriate for the permeability assays, presenting the highest integrity of the cell monolayer and the highest levels of TAS2R14 expression. Additionally, RT-PCR was performed to confirm TAS2R14 expression in both cell lines. The permeability of the barriers to quercetin was not determined, due to completely degradation after 3 hours. Nevertheless, the expression levels of ABCC1 and ABCC4 were assessed in the blood–cerebrospinal fluid barrier cell line following TAS2R14 knockout and subsequent exposure to quercetin. However, no alterations in ABCC1 and ABCC4 expression in mock or TAS2R14 silenced conditions were detected. Lastly, lactisole permeability was assessed in the blood–cerebrospinal fluid barrier model, and a threefold higher concentration was observed in the apical compartment after 4 hours. Thus, it was concluded that lactisole crosses the blood–cerebrospinal fluid barrier in a timedependent manner.Os tumores cerebrais representam uma das formas mais letais de cancro. A sua complexa localização, a dificuldade de um diagnóstico precoce e as limitações no tratamento, fazem com que estes tumores apresentem um prognóstico muito reservado. As barreiras cerebrais, são barreiras biológicas altamente seletivas que controlam a passagem de compostos entre o sangue e o cérebro. Apesar de serem fundamentais para manter a proteção e homeostasia cerebral, a sua alta seletividade faz com que os agentes quimioterapêuticos não consigam alcançar o parênquima cerebral em concentrações suficientes. Assim, para além da agressividade característica dos tumores cerebrais, a limitada biodisponibilidade dos agentes anticancerígenos torna o tratamento ainda mais desafiante. Esta permeabilidade restrita é mediada pela superfamília de transportadores ABC, expressos na barreira hematoencefálica e barreira sangue-líquido cefalorraquidiano. Estes transportadores, ao utilizarem energia da hidrólise da ATP, controlam o efluxo ativo de diversas moléculas através das membranas celulares, nomeadamente de compostos anticancerígenos. Os recetores de sabor doce (TAS1R) e os recetores de sabor amargo (TAS2R), usualmente associados à cavidade oral, foram identificados em tecidos extraorais e em tumores, emergindo assim como potenciais biomarcadores cancerígenos e alvos terapêuticos. Compostos que interagem com estes recetores têm sido alvo de estudo pelo nosso grupo de investigação. O lactisole, um composto que inibe a perceção do sabor doce ao ligar-se à subunidade T1R3, apresenta propriedades anticancerígenas, diminuindo a viabilidade e a migração celular, assim com o uptake da glucose das células de glioblastoma. Por outro lado, outros estudos revelaram que a ativação dos TAS2Rs, mais especificamente, do TAS2R14, influencia a expressão dos transportadores ABC. Esta relação é de particular interesse pois uma redução da atividade destes transportadores poderá aumentar a acumulação intracelular de compostos anticancerígenos. Além disso, evidências sugerem que os TAS2R podem desempenhar um papel importante na regulação da apoptose, já que a sua expressão se encontra alterada em tecidos tumorais, podendo contribuir para a proliferação celular descontrolada. A quercetina, um composto amargo que ativa o TAS2R14, tem demonstrado potencial terapêutico ao melhorar a quimiorresistência e induzir a apoptose em celulas cancerígenas. Assim, o trabalho apresentado nesta dissertação de mestrado teve como objetivo determinar se a barreira hematoencefálica e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano são permeáveis ao lactisole e à quercetina, e se a interação entre a quercetina e o TAS2R14 modula a expressão dos transportadores ABC. Para isso, utilizou-se uma linha celular de papiloma do plexo coroide humano (HIBCPP) e uma linha celular de endotélio microvascular cerebral humano (hCMEC/D3). Estas linhas celulares foram escolhidas com o objetivo de estabelecer modelos in vitro que mimetizem as características fenotípicas in vivo do microambiente da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano e barreira hematoencefálica, respetivamente. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para garantir que os compostos não apresentavam citotoxicidade para as células em estudo, tendo-se verificado que o lactisole não diminuiu a viabilidade na linha celular HIBCPP. No entanto, nas células hCMEC/D3, observou-se uma diminuição na viabilidade celular que poderá estar associada à elevada concentração do veículo onde foi dissolvido o composto. Através de medições da resistência elétrica transepitelial e imunocitoquímica, foi possível otimizar o modelo da barreira hematoencefálica, que ainda não tinha sido estabelecido no nosso grupo de investigação. O 6.º dia de cultura revelou ser o mais adequado para os ensaios, apresentando maior integridade da monocamada celular e níveis superiores de expressão do recetor TAS2R14. Além disso, realizou-se um RTPCR para confirmar a expressão de TAS2R14 em ambas as linhas celulares. A permeabilidade das barreiras à quercetina não foi determinada pois constatou-se que esta se degradava completamente ao fim de 3 horas, impossibilitando a análise da sua passagem através das barreiras. Ainda assim, foi avaliada a expressão dos transportadores ABCC1 e ABCC4 na barreira sangue-líquido cefalorraquidiano em resposta à quercetina. No entanto, não foram detetadas alterações na expressão destes transportadores, pelo menos dependentes da ativação do TAS2R14. Por fim, a permeabilidade do lactisole foi avaliada no modelo da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano, tendo-se observado uma concentração 3 vezes superior no compartimento apical ao fim de 4 horas. Assim, foi possível demonstrar que o lactisole atravessa a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano, de forma dependente com o tempo.engBarreira HematoencefálicaBarreira Sangue-Líquido CefalorraquidianoRecetores de Sabor DoceRecetores de Sabor AmargoTransportadores ABCLactisoleQuercetinaBlood-Brain BarrierBlood-Cerebrospinal Fluid BarrierSweet Taste ReceptorsBitter Taste ReceptorsABC TransportersQuercetinmaster thesis204036810