Nilsson, StaffanCabral, Ana Cristina Mendes DiasLemos, Sandra2015-11-202015-11-202008http://hdl.handle.net/10400.6/3901New insights into biomedicine and related areas require the parallel development of new analytical methods. A technique for chemical analysis based on the use of acoustically levitated droplets, suitable for the study of intra and extracellular reactions at single or few cells level has been developed. Microenvironments suited for specific cell types and cell reactions can be created in levitated droplets to serve as biomimetic systems. The applicability of the Airborne System is broad and circumvents limitations associated with chip-based analytical systems, such as adsorption of the analytes or optical interferences at the walls of the sample containers. Furthermore, the low attomole detection limit highlights the potential of the method. Dysfunctional adipocytes and insulin-producing pancreatic β-cells are dynamic parts in the development of type 2 diabetes. The mechanisms involved are however not yet fully understood. With this project we aim to give our contribution for the understanding of the phenomena associated with the development of the disease and at the same time provide science with new tools which can be useful in the pursuit of new knowledge, as well as in the development of novel drugs, both in type 2 diabetes or in other metabolic diseases. The system was here applied in cellular studies at the single/few cell level. Reagents are added to the droplet using flow-through dispensers, with no physical contact with the droplet. After exposure of the cells to drugs, activators or inhibitors, the cell response (or lack of response) is monitored using fluorescence imaging detection and MALDI-TOF-MS. Adipocyte lipolysis was followed. Stimulation of lipolysis with isoprenaline resulted in a pH decrease detectable by this methodology. Moreover, the addition of insulin resulted in the inhibition of isoprenaline stimulated lipolysis in adipocytes in the levitated droplet. The addition of glycated insulin to an adipocyte containing droplet revealed not to be as effective to stop lipolysis as non-glycated insulin, which is na important finding in the search for new targets in type 2 diabetes related research. Additionally, we are now attempting to develop techniques which can interrogate and monitor analytes of interest in a levitated droplet, non-destructively, ondemand, and over extended periods of time and in real-time by MS. In current work droplet fission is induced by polarization in a containerless environment. Various electrode configurations are attempted varying parameters such as number and shape, voltage, pulse length and frequency for the applied electric field in order to get the proper droplet response. Miniaturization and single-cell analysis could ultimately result in a decreasing of the number of animal trials necessary in medical research.Inovações em biomedicina e áreas relacionadas exigem o paralelo desenvolvimento de novos métodos analíticos. Assim, a técnica aqui apresentada é baseada na levitação acústica de pequenas amostras. O estudo de reacções intra e extracelulares utilizando apenas uma ou poucas células é, desta forma, possível. Microambientes adequados ao estudo the específicos tipos celulares e respectivas reacções podem assim ser criados, funcionando como sistemas biomiméticos. As aplicações do Airborne System são variadas. Com esta técnica algumas limitações, tais como a adsorção dos analitos e interferências ópticas devido à presença de superficies, associadas com outras técnicas de miniaturização incluindo as que se baseiam no uso de chips, são eliminadas. Além do mais, a possibilidade de detecção ao nível da attomole aumenta ainda mais o potencial desta técnica. Adipócitos disfuncionais bem como as células produtoras de insulina – células β - são factores importantes envolvidos no desenvolvimento da diabetes tipo 2. No entanto, estes mecanismos não são ainda totalmente conhecidos. Com este projecto pretendemos contribuir para a compreensão dos fenómenos associados com o desenvolvimento da doença e ao mesmo tempo equipar a ciência com novas ferramentas que poderão ser úteis, quer na descoberta quer no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento, não só, da diabetes tipo 2, como de outras doenças metabólicas. O Airborne System foi aqui aplicado no estudo do metabolismo dos adipócitos ao nível de uma/poucas células. Os reagentes são adicionados à gota levitada usando flow-through dispensers, sem qualquer contacto físico. Depois de expostas tanto a drogas activadoras como inibitórias, a resposta das células (ou a falta dela) é monotorisada usando fluorescence imaging detection e MALDI-TOF-MS. A estimulação da lipólise em adipócitos é feita através da adição de isoprenalina. A resultante diminuição dos valores de pH do meio pode ser então detectada com o uso desta metodologia. A inibição da lipólise iniciada com a administração de isoprenalina foi conseguida através da adição de insulina. Em paralelo, a administração de insulina glicada, revelou não ser tão eficaz no objectivo de parar a lipólise, como foi a insulina não glicada. Este facto representa uma descoberta importante na procura de novos caminhos que levem ao total conhecimento dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da diabetes tipo 2. Ainda, estamos no momento a aplicar esforços no desenvolvimento the técnicas que nos permitam seguir a resposta das células de forma não destrutiva, por longos períodos de tempo e em tempo real utilizando MS. Actualmente, a fissão da gota levitada é induzida através da polarização de cargas num ambiente em que não existe qualquer contacto da gota com superficies externas. Eléctrodos com várias configurações são testados, fazendo variar parâmetros tais como o valor e o perfil da voltagem aplicada, frequência e comprimento dos pulsos aplicados no campo eléctrico, de forma a conseguir uma resposta apropriada por parte da gota em levitação. O desenvolvimento desta técnicas analítica poderá, em última análise levar a uma diminuição do número de animais sacrificados diáriamente em laboratório.engLevitação acústicaInsulinaDiabetes tipo 2master thesis