Passarinha, Luís António PaulinoSantos, Fátima Raquel Milhano dosAmaral, Andreia Vanessa Guedes2019-04-042019-04-042016-11-112016-10-10http://hdl.handle.net/10400.6/6981In the last years, plasmid DNA has been used as a vector for gene therapy and DNA vaccines, and for this reason, the ability to produce large quantities of plasmid DNA is important concerning the DNA vaccines production process, on an industrial scale. Thus, the objective of this research was to study the metabolism and proteome of Escherichia coli (strain VH35) during the pcDNA- FLAG-p53 biosynthesis using as alternative media agro–food industry compounds, as cheese whey, corn steep liquor and yeast extract. Combining these alternative compounds as a growth medium, and using strain VH35 as a host, the optimization of plasmid DNA production was performed in terms of yield and quality. After this optimization, it was analyzed the consumption of sugars in the fermentation medium overtime, and the proteome changes that occur due to metabolic adaptations. The developed work suggests that strain VH35 uses agro-food media as an energy source, thus consuming the lactose present in the agro-food medium, since it does not contain PTS–sugars. Due to the fact that this alteration can lead to proteome modifications in the cell, proteomic analysis was performed using two-dimensional electrophoresis, which showed that the protein composition of strain VH35 was different among the compared growth mediums. Lastly, these proteome changes were analyzed by MALDI-TOF/TOF, and it was possible to identify differentially expressed proteins, such as anthranilate synthase component 1, chaperone protein ClpB, deoxyribose-phosphate aldolase, that are related principally to metabolic pathways and nucleotides synthesis.Nos últimos anos, o DNA plasmídico tem sido usado como um vetor em terapia génica e em vacinas de DNA, e por essa razão, a capacidade de produzir grandes quantidades de plasmídeo é importante no que diz respeito ao processo de produção de vacinas de DNA, em larga escala. Assim, o objetivo deste trabalho foi o estudo metabólico e proteómico da Escherichia coli (estirpe VH35) durante a síntese de pcDNA-FLAG-p53, usando como meio de fermentação compostos alternativos provenientes da indústria agro–alimentar, como o soro de queijo, o “corn steep licor” e o extrato de levedura. Combinando estes compostos alternativos como meio de crescimento, e usando a estirpe VH35 como hospedeiro, procedeu-se então à otimização da produção de DNA plasmídeo, em termos de rendimento e qualidade. Após essa otimização, analisou-se o consumo de açúcares no meio de fermentação ao longo do tempo, e as alterações proteómicas que ocorrem devido a adaptações metabólicas. O trabalho desencolvido sugere que a estirpe VH35 utiliza meios agro-alimentares como fonte de energia, consumindo assim a lactose presente no meio, uma vez que estes meios não possuem açúcares PTS (fosfoenolpiruvato). Devido ao facto desta alteração poder levar a modificações no proteoma da célula, foi feita uma análise proteómica por eletroforese bidimensional, que revelou variações no proteoma da célula quando comparado com diferentes meios de crescimento. Por fim, essas variações proteómicas foram analisadas por MALDI-TOF/TOF, e foi possível identificar proteínas diferencialmente expressas, como por exemplo a proteína MreB, a desoxirribose fosfato – aldolase, chaperonina ClpB,as quais se encontram principalmente relacionadas com o metabolismo e a síntese de nucleótidos.engCorn Steep LicorDna PlasmídicoEletroforese BidimensionalEscherichia Coli Vh35ProteómicaSoro de Queijomaster thesis202210162