Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraMendonça, António José Geraldes deVapor, Alcides Walter2022-09-082022-09-082022-06-06http://hdl.handle.net/10400.6/12348Food allergies are caused by abnormal immune responses to food components (allergens), namely proteins. For this reason, eggs are one of the richest foods in the food chain and are therefore essential for a healthy diet. However, worldwide 6-9 % of the child population and 4 % of adults are allergic to eggs, which prevent their consumption or any derived products. Hen’s egg allergy has increased worldwide due to the ubiquitous of eggs in the diet. Ovalbumin (OVA) is the most abundant protein in the egg white and causes allergy, especially in children and young children, being one of the most common food allergies, mediated by IgE. Until now, the processes used to decrease the allergenicity of egg proteins, such as cooking, thermal processing, and enzymatic digestion have not been totally effective, because the allergens have high stability and resistance. Thus, there are no drugs to prevent allergic reactions, and avoiding the egg has been the only way to prevent this allergy. Phenolic compounds (PC) are recognized as having a potent antioxidant, anti-inflammatory, antibacterial, antiviral and antitumor activity. In addition, these compounds, present in fruits and vegetables, can bind to peptides and proteins to form complexes, being able to promote alteration of its native conformation and to contribute to the reduction of allergenicity. Therefore, the goal of this work was the development of a process to reduce the allergenicity of hen egg proteins through the action of natural antioxidants, such as PC, under different experimental conditions, in order to promote alterations of proteins native structure, and concomitantly, of its allergenic capacity. Spectroscopic techniques have stood out among the various methods, as they use small amounts of sample, do not cause damage of the sample and can be used in different experimental conditions to analyse the conformational changes that can occur during the chemical, physical and enzymatic modifications of proteins. Thus, the OVA changes promoted by the different PC were evaluated using techniques such as circular dichroism (CD), fluorescence and total attenuated reflection - infrared Fourier transform (ATR-FTIR). The OVA solutions were incubated at different temperatures, with different PC (gallic, caffeic, ferulic, chlorogenic and tannic acids, resveratrol and quercetin) prepared with the same buffer solution. The results showed that the structure of OVA was affected by the binding of these compounds. The fluorescence spectra demonstrated that the PC quenched the fluorescent amino acid tryptophan, which means that the interactions occurred directly or close to this amino acid residue. It was also observed that the fluorescence of OVA solutions decreased with increasing PC concentration. The quenching mechanism calculated from the Stern-Volmer constant (KSV) and the bimolecular quenching constant (Kq) suggests a static quenching mechanism. However, when considering the effect of temperature variation (298.15 to 318.15 K and 318.15 to 328.15 K) on fluorescence quenching, it was found that KSV and Kq decreased with the increase of temperature in some OVA-PC complexes, leading to a dynamic extinction mechanism. On the other hand, for other complexes, KSV and Kq increased with increasing temperature, or remained constant, suggesting, respectively, a static extinction mechanism and a mixed extinction mechanism (static and dynamic). The same effect was observed for the binding constant Kb, with temperature change. Furthermore, the thermodynamic analysis, according to the values found for ΔH and ΔS for all OVA-PC complexes tested, at both temperatures, suggested that the reactions occurred spontaneously (ΔG<0) with the participation of weak interactions, namely hydrophobic interactions and hydrogen. The experiments with CD and ATR-FTIR showed changes in the secondary structure of OVA, originated by the conversion of the α-helix into β- sheets. Molecular docking showed that the PC can interact directly with OVA epitopes or in its neighborhood, preventing IgE binding. Therefore, the application of natural antioxidants, such as PC, in the treatment of egg proteins appears to be a potential alternative to the current methods used in reducing the allergenicity of egg proteins. In fact, all PC bound to OVA, changing its secondary and tertiary structure. As future perspectives, in-depth studies will be carried out with the whole egg treated with selected PC, to evaluate the binding of the specific IgE, as a strategy to reduce allergy to eggs and to produce hypoallergenic eggs. The confirmation of the decrease of allergenicity will be carried out by immunoblotting and ELISA tests with sera from patients allergic to egg and comparing the levels of specific IgE that binds to treated and untreated OVA with PC. Subsequently, the reduction/elimination of allergenicity in vivo will be evaluated by skin prick tests in allergic patients using OVA and whole egg extracts, treated with PC. It is expected to produce an egg-derived product that allows the egg-allergic population to consume it.As alergias alimentares são causadas por respostas imunológicas anormais a componentes dos alimentos, nomeadamente proteínas (alergénios). Por esta razão, os ovos são um dos alimentos mais ricos da cadeia alimentar, sendo deste modo essenciais numa alimentação saudável. Contudo, a nível mundial cerca de 6-9 % da população infantil, e 4 % dos adultos, é alérgica aos ovos, o que impede o seu consumo ou de qualquer produto derivado. A alergia ao ovo de galinha tem aumentado em todo o mundo devido à omnipresença dos ovos na dieta, sendo uma das alergias alimentares mais comuns mediada por imunoglobulina E (IgE). A ovalbumina (OVA) é a proteína que existe em maior abundância na clara do ovo e a principal causa de alergia ao ovo em crianças e adolescentes. Até ao momento, os processos utilizados para a diminuição da alergenicidade das proteínas do ovo, como o tratamento térmico e digestão enzimática, entre outros, não têm sido totalmente eficazes, porque alguns alergénios apresentam elevada estabilidade e resistência. Assim, não existem ainda soluções industriais totalmente eficazes, nem medicamentos para a prevenção das reações alérgicas ao ovo, pelo que a sua evicção tem sido a única maneira de prevenir a alergia. Os compostos fenólicos são reconhecidos como possuindo variadas atividades biológicas, como por exemplo: antioxidante; anti-inflamatória; antibacteriana; antiviral e antitumoral. Além disso, estes compostos, presentes na fruta e vegetais, ligam-se a péptidos e proteínas para formar complexos, podendo promover alteração da sua conformação nativa e, contribuir para a diminuição da alergenicidade. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo para diminuição da alergenicidade das proteínas do ovo, nomeadamente da OVA, através da ação dos compostos fenólicos, em diferentes condições experimentais, de modo a promover alteração da sua estrutura nativa, e concomitantemente, da sua capacidade alergénica. As técnicas espectroscópicas têm-se destacado pelo facto de necessitarem de pequenas quantidades de amostra, não serem destrutivas e poderem ser utilizadas sob diferentes condições experimentais. Deste modo, as principais alterações na estrutura proteica foram avaliadas através de dicroísmo circular (CD), fluorescência e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e reflexão total atenuada (ATR-FTIR). Como modelo, soluções de OVA em tampão fosfato 0.05 M, pH 7.40, foram incubadas a diferentes temperaturas, com vários compostos fenólicos (ácidos: gálico; cafeico; ferúlico; clorogénico e tânico; resveratrol e quercetina) preparados com a mesma solução tampão. Os resultados demonstraram que a estrutura da OVA foi afetada pela ligação dos compostos fenólicos. Os espectros de fluorescência mostraram que os compostos fenólicos provocaram a extinção da fluorescência dos resíduos de triptofano da OVA, o que significa que as interações ocorreram diretamente ou próximo desses resíduos. A fluorescência das soluções de OVA diminuiu com o aumento da concentração dos compostos fenólicos. O mecanismo de quenching calculado a partir da constante de Stern-Volmer (KSV) e da constante de quenching bimolecular, sugere um mecanismo de quenching estático. No entanto, ao considerar-se o efeito da variação da temperatura (298,15 a 318,15 K e 318,15 a 328,15 K) na extinção de fluorescência, verificou-se que KSV e Kq diminuíram quando a temperatura aumentou para alguns complexos OVA-compostos fenólicos, levando a um mecanismo de extinção dinâmico. Por outro lado, para outros complexos, KSV e Kq aumentaram com o aumento da temperatura, ou mantiveram-se constantes, sugerindo, respectivamente, um mecanismo de extinção estático e um mecanismo de extinção misto (estático e dinâmico). O mesmo efeito foi observado para a constante de ligação Kb, com mudança de temperatura. Além disso, a análise termodinâmica, de acordo com os valores encontrados de ΔH e ΔS para todos os complexos de OVA com compostos fenólicos testados, em ambas as temperaturas, sugeriu que as reações ocorreram espontaneamente (ΔG<0) com a participação de interações fracas, principalmente hidrofóbica e pontes de hidrogénio. As experiências com CD e ATR-FTIR indicaram alterações na estrutura secundária da OVA, originadas principalmente pela conversão das hélices α em folhas β. O docking molecular mostrou que os compostos fenólicos testados podem interagir diretamente com os epítopos da OVA ou na sua proximidade, evitando presumivelmente a ligação de IgE. Em conclusão, todos os compostos fenólicos ligaram à OVA, alterando a sua estrutura terciária e secundária, sugerindo, deste modo, a aplicação destes antioxidantes naturais no tratamento das proteínas do ovo, como potencial alternativa para diminuir a sua alergenicidade. Como perspetivas futuras, deverão ser realizados estudos com o ovo completo a que os compostos fenólicos selecionados serão adicionados, para avaliar a ligação da IgEespecífica, pondo em prática a aplicação destes compostos como uma estratégia para redução da alergia aos ovos e produção de derivados de ovo hipoalergénicos. A confirmação da diminuição da alergenicidade, será realizada através de immunoblotting e ELISA com soros de doentes alérgicos ao ovo e comparando os níveis de IgE específica que se liga à OVA tratada e não tratada com compostos fenólicos. Posteriormente, a redução/eliminação da alergenicidade in vivo será avaliada por meio de testes de picada na pele em doentes alérgicos, utilizando extractos de OVA e de ovo inteiro, tratados com compostos fenólicos. Espera-se produzir um produto derivado do ovo que permite à população alérgica ao ovo, o seu consumo..engAlergia ao ovoAlergia alimentarAlergenicidadeCompostos fenólicosOvalbuminaTécnicas espectroscópicasdoctoral thesis101580177