Cruz, Carla Patrícia Freire Madeira Alves daBaptista, Pedro Miguel Ribeiro VianaAlexandre, Daniela de Jesus2026-05-042026-05-042026-03-27http://hdl.handle.net/10400.6/20080Non-small cell lung cancer (NSCLC) requires biomarkers that are both sensitive and actionable, as well as network-level therapies. In this context, microRNAs (miRs) have emerged as a unique bridge to meet these needs: their dysregulated signatures discriminate healthy individuals from NSCLC patients, while serving as regulators, each miR can coordinate multiple gene targets, making them compelling therapeutic levers. Leveraging this duality, the present thesis harnesses that property to test a “one-hit, multiple-target” strategy centered on miRs (miR-21, miR-155-3p, miR-3196), integrating sensitive detection with therapeutic modulation. To this end, multiple miRs were initially profiled in NSCLC liquid biopsies (LBs). Subsequently, molecular beacons (MBs) were engineered and qualified for the direct detection of two NSCLC-associated miRs (miR-21/miR-155) in biological samples, laying the groundwork for a diagnostic platform; additionally, one probe was integrated into a microchip, enabling a point-of-care diagnostic prototype. Therapeutically, miR-155-3p was silenced with an antisense strategy, and miR-3196 was reactivated by destabilizing a G-quadruplex (G4) within its precursor using a G4 ligand (phenylpyrrolocytosine; PhpC). To enable efficient intracellular delivery, gold nanoparticles (AuNPs) were developed to deliver both oligonucleotides and PhpC ligand, with complete physicochemical and cellular characterization. Overall, the expression profile analysis identified upregulation of miR-21/miR-155 and downregulation of miR-3196, with clinical correlations. The MB assays achieved high specificity and low-nanomolar sensitivity, enabling rapid readouts. Additionally, the AuNPs targeting miR-155-3p produced efficient cellular uptake and robust knockdown, attenuating oncogenic signaling and outperforming lipid transfection. Moreover, to the best of our knowledge, we have identified, for the first time, a G4-forming region within the human precursor of miR-3196 that restricts its maturation. Subsequently, using the G4 ligand, PhpC, unfolded this structure and restored mature miR-3196. In addition, PhpC-functionalized AuNPs preserved activity, enhanced intracellular persistence, and maintained low acute cytotoxicity across the tested ranges. These studies establish a theragnostic framework for NSCLC: MBs enable minimally invasive detection and real-time pharmacodynamic tracking, while miR modulation, via miR-155 inhibition and G4-guided rescue of miR-3196, may yield broad antitumor effects from a single molecular hit. Furthermore, the AuNP delivery overcomes key barriers to nucleic-acid and small-molecule therapeutics. Collectively, the work advances a translatable, miR-centered one-hit/multi-target paradigm and outlines clear next steps toward in vivo validation and clinical integration.O cancro do pulmão de não pequenas células (CPNPC) exige biomarcadores simultaneamente específicos e clinicamente acionáveis, bem como terapias direcionadas capazes de modular múltiplas vias moleculares., em vez de visarem um único gene/proteína. Neste contexto, os microRNAs (miRs) através dos seus perfis de desregulação podem discriminar indivíduos saudáveis de doentes com NSCLC e, atuar como reguladores coordenando múltiplos alvos génicos, tornando-os terapêuticas promissoras. Tirando partido desta dualidade, a presente tese investiga a estratégia one-hit, multiple-target centrada em miRs (miR-21, miR-155-3p, miR-3196), integrando a deteção com a modulação terapêutica. Para tal, foi inicialmente determinado o perfil de múltiplos miRs em biópsias líquidas de doentes com CPNPC. Subsequentemente, foram desenhadas e validadas sondas moleculares (SMs) para a deteção direta de dois dos miRs associados ao CPNPC (miR-21/miR-155) em amostras biológicas, estabelecendo a base de uma solução diagnóstica; adicionalmente, uma das SMs foi integrada num microchip, viabilizando um protótipo point-of-care para diagnóstico. Do ponto de vista terapêutico, o miR-155-3p foi silenciado através de uma estratégia antisense, e o miR-3196 foi reativado por destabilização do G-quadruplex (G4) no seu precursor usando um ligando de G4 (fenilpirrolocitosina; PhpC). Para viabilizar uma entrega intracelular eficiente, foram desenvolvidas nanopartículas de ouro (AuNPs) para veicular tanto os oligonucleótidos como o ligando PhpC, com a respetiva caracterização físico-química e celular. Globalmente, a análise do perfil de expressão identificou a sobre-expressão do miR-21/miR-155 e a sub-expressão do miR-3196, com correlações clínicas. Os ensaios com as SMs apresentaram elevada especificidade e sensibilidade na gama do nanomolar, permitindo leituras rápidas. Adicionalmente, as AuNPs direcionadas ao miR-155-3p promoveram uma internalização celular e um silenciamento eficientes atenuando a sinalização oncogénica e superando a transfeção lipídica. Para além disso, identificou-se uma região formadora de G4 no precursor humano do miR-3196 que impede a sua maturação. Subsequentemente, o ligando PhpC destabilizou a estrutura de G4 restaurando a expressão do miR-3196 maduro. As AuNPs funcionalizadas com o ligando PhpC preservaram a sua atividade, aumentaram o tempo de ação intracelular e mantiveram baixa citotoxicidade nas gamas testadas. Estes estudos estabelecem um enquadramento teranóstico para o CPNPC: os SMs possibilitam deteção minimamente invasiva e monitorização farmacodinâmica em tempo real, enquanto a modulação de miRs, via inibição do miR-155 e restauro do miR-3196 guiado por G4, pode produzir efeitos antitumorais a partir de moléculas direcionadas e específicas. Além disso, o transporte por AuNPs permitem modular a degradação, biodistribuição e entrega intracelular, otimizando a eficácia de terapias baseadas em ácidos nucleicos e pequenas moléculas ( 500 Da). Em suma, esta tese propõe uma estratégia transladável, centrado em miRs, de one-hit/multi-target e estabelece estratégias futuras bem delineadas para a validação in vivo e integração clínica.engmicroRNAsPerfil de expressãoSondas MolecularesTerapia AntisenseModulação de estruturas de G-quadruplexExpression profilingMolecular BeaconsAntisense TherapyG-quadruplex modulationdoctoral thesis101716982