Correia, Ilídio Joaquim SobreiraMiguel, Sónia Alexandra Pereira2020-06-092022-09-052019-12http://hdl.handle.net/10400.6/10311According to the World Health Organization, it is estimated that 180 000 deaths occur, every year, as consequence of burns. In United States, it is expected that chronic wounds (e.g. diabetic and pressure ulcers) affect 6.5 million people. Thus, skin lesions are a public health problem. To minimize the effects of skin injuries, it is crucial to protect the wound site for decreasing the risk of infection, as well as promote/accelerate the wound healing process. In this context, researchers have been developing different types of biomaterials (e.g. hydrocolloids, sponges, hydrogels, membranes) to provide a barrier against microorganisms, avoid the dehydration, and enhance the healing process. Among them, the membranes obtained through the electrospinning technique have been investigated for wound dressing applications. This technique allows the production of fibers networks with diameters between 50-500 nm, that mimic the dimensions of the collagen fibers found in the skin’ extracellular matrix. Furthermore, the membranes’ high porosity and small pore size allow gaseous exchanges and exudates absorption, as well as provide protection at the wound site from microorganisms’ invasion and dehydration. Moreover, the electrospun membranes have been functionalized with antibacterial molecules (e.g. antibiotics, silver nanoparticles, and natural extracts) or molecules with biological activity (growth factors, vitamins, and anti-inflammatory) to improve the skin regeneration process. Among the different types of molecules, the natural extracts, like Aloe Vera (AV) and essential oils, have triggered the attention of the researchers to produce wound dressings, due to their excellent biological properties and beneficial effects for the healing process. More recently, researchers started to explore the production of the membranes with asymmetric structure to be applied as wound dressings. These membranes are composed of two layers, that mimic the morphology of native skin, thereby reproducing the properties of the epidermis and dermis. Heretofore, the asymmetric membranes were mainly produced by using dry/wet phase and supercritical carbon dioxide (scCO2)- assisted phase inversion techniques. Taking this into consideration, the work plan developed during my PhD had as main goal to explore the electrospinning technique to produce asymmetric membranes, aimed to improve healing process. To accomplish that, different strategies were explored: i) production of asymmetric electrospun membranes by combining different types of polymers (naturals (silk fibroin (SF), hyaluronic acid (HA), silk sericin (SS) and/or synthetic); ii) incorporation of biomolecules within nanofibers to improve the biological properties of membranes (AV and thymol (THY)); iii) combination of the electrospun nanofibrous membranes with three-dimensional (3D) printed hydrogels, to obtain an asymmetric skin substitute. In the first study presented in thesis, an asymmetric electrospun membrane with a top layer composed of Polycaprolactone (PCL) and a bottom layer of CS/AV was produced and characterized. The results obtained in this study demonstrated that the low porosity and hydrophobic character exhibited by top layer was crucial to avoid the microorganism infiltration (S. aureus) and Escherichia coli (E. coli)). On the other side, the AV incorporation into CS nanofibers allowed the production of a bottom layer that was able to provide a moist environment at the wound site, as well as promote an improved fibroblasts’ adhesion and proliferation. Further, the microorganism growth at bottom layer’ surface was inhibited due to the antimicrobial properties of CS and AV. In the second study presented herein, SF was used to produce an asymmetric electrospun nanofibrous membranes, in which a bioactive compound (THY) was incorporated to improve the wound healing process. SF is a fibrous protein, that presents excellent biocompatibility, good water vapor permeability, biodegradability, mechanical strength, and minimal inflammatory reaction. In this way, the SF was combined with PCL to produce the top layer, that mimic the epidermis layer. On the other hand, SF was also mixed with HA to produce a bottom layer that mimic the dermis layer. This polymeric combination allowed the production of a structure able to absorb the wound exudates and promote the cell’s adhesion and proliferation. In addition, THY was incorporated into the bottom nanofibrous membrane to provide antibacterial and antioxidant properties. The results obtained showed that the top layer of the asymmetric membrane displays a low porosity was able to avoid microorganisms’ infiltration, whereas the high porosity of the bottom layer is crucial to assure a moist environment at the wound site as well as promote the cellular migration/infiltration. Further, the mechanical assays demonstrated that the asymmetric membranes displayed mechanical parameters that are similar to those exhibited by native skin. On the other side, the in vitro assays demonstrated that the human fibroblasts adhered and proliferated at the membranes’ surface, and the THY incorporation into bottom layer conferred antioxidant and antibacterial properties to the membrane. In the third study presented in this thesis, a 3D skin asymmetric construct (SAC) was produced, by combining the electrospinning and the 3D printing techniques. In this work, the asymmetric skin construct was obtained through the combination of materials (that was performed for the first time) and by using different production techniques to reproduce the properties/structure of epidermis and dermis. In this way, the electrospinning technique was used to obtain a top layer composed of a nanofibrous mesh presenting excellent mechanical properties and gaseous exchange capacity. On the other side, the dermis-like layer was produced by using the 3D printing of hydrogel, allowing to achieve a 3D structure able to absorb high amounts of exudate, as well as to promote the cell migration. The obtained results demonstrate that the epidermis-like top layer composed of PCL and SS electrospun nanofibers avoided the microorganisms’ infiltration (S. aureus and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)) and displayed excellent mechanical properties quite similar to those of the native skin. In contrast, the bottom layer produced, by performing the 3D printing of CS and sodium alginate (SA) hydrogel, presented suitable porosity, wettability, and biological properties that supported fibroblasts’ adhesion, migration and proliferation. Further, the antimicrobial properties of CS enabled the inhibition of the S. aureus and P. aeruginosa growth at the bottom layer’s surface. Overall, the results obtained in these experimental works demonstrate the versality of the electrospinning technique, which allows to combine different natural/synthetic polymers, incorporate biomolecules within nanofibers, and produce two distinct layers that mimic the epidermis and dermis features. On the other side, membranes’ performance on the treatment of skin injuries can be improved by the incorporation of biomolecules or cells. The use of the other techniques can also be hypothesized to produce structures with a personalized shape/size that fulfil the patient needs. Further, the realization of in vivo assays may reveal promising results that will speed up the evaluation of these skin substitutes in clinical assays.A Organização Mundial de Saúde estima que, anualmente, 180 000 mortes ocorrem como consequência de queimaduras. Só nos Estados Unidos, as feridas crónicas (por exemplo úlceras diabéticas e de pressão) afetam 6,5 milhões de pessoas. Desta forma, as lesões cutâneas constituem uma das maiores preocupações de saúde a nível mundial. Com o objetivo de minimizar os efeitos das lesões cutâneas, é crucial proteger a lesão de forma a reduzir o risco de infeção e, por outro lado, promover/acelerar o processo de cicatrização. Neste contexto, os investigadores têm desenvolvido diferentes tipos de biomateriais (hidrocolóides, esponjas, hidrogéis, membranas, etc.), que sejam capazes de estabelecer uma barreira mecânica contra os microrganismos, prevenir a desidratação e, ainda, acelerar o processo de cicatrização. Nos últimos anos, as membranas produzidas através da técnica de electrofiação têm sido intensamente investigadas para aplicação no tratamento de feridas. Esta técnica permite a produção de redes de nanofibras com diâmetros entre 50-500 nm, que reproduzem a estrutura das fibras de colagénio presentes na matriz extracelular da pele nativa. Por outro lado, a elevada porosidade e o tamanho de poro exibido pela rede de nanofibras permitem as trocas gasosas, a absorção do exsudado das feridas, e conferem proteção ao local da ferida contra a invasão por microrganismos e a desidratação. Além disso, as membranas eletrofiadas têm sido funcionalizadas com moléculas com atividade antimicrobiana (por exemplo antibióticos, nanopartículas de prata e extratos naturais), ou com atividade biológica (fatores de crescimento, vitaminas e anti-inflamatórios), com o objetivo de melhorar o processo de cicatrização de feridas. Entre os diversos tipos de moléculas utilizados até ao momento, os extratos de origem natural, como sejam os de Aloe Vera e os óleos essenciais têm sido incorporados nos revestimentos cutâneos, devido às suas excelentes propriedades biológicas e aos efeitos benéficos que estes apresentam para o processo de cicatrização. Por outro lado, os investigadores começaram, recentemente, a explorar a produção de membranas assimétricas para aplicação como revestimentos cutâneos. Estas membranas são compostas por duas camadas, que mimetizam a morfologia da pele nativa, i.e. reproduzem a estrutura da epiderme e da derme. Até ao momento, as membranas assimétricas foram principalmente produzidas através da técnica de inversão de fase seca/húmida e da técnica de inversão de fases por dióxido de carbono supercrítico (scCO2). Tendo isto em conta, o plano de trabalhos desenvolvido durante o meu doutoramento teve como principal objetivo explorar a técnica de electrofiação para a produção de membranas assimétricas que possam ser usadas para melhorar o processo de cicatrização de feridas. Para tal, foram exploradas diferentes estratégias: i) produção de membranas assimétricas combinando diferentes tipos de polímeros naturais (fibroína de seda (SF), ácido hialurónico (HA), sericina de seda (SS)), e/ou sintéticos; ii) incorporação de biomoléculas no interior das nanofibras com o objetivo de melhorar as propriedades biológicas das membranas (Aloe Vera e timol (THY)); iii) combinação das membranas nanofibrosas com hidrogéis produzidos por impressão tridimensional (3D), de forma a obter um substituto de pele com geometria assimétrica. No primeiro estudo apresentado nesta tese, foi produzida e caracterizada uma membrana assimétrica composta por uma camada superior de Policaprolactona (PCL) e uma camada inferior de Quitosano (CS)/Aloe Vera. A escolha do polímero sintético e hidrofóbico (PCL) para produzir a camada superior permitiu obter uma membrana densa capaz de fornecer suporte mecânico ao local da lesão. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a baixa porosidade e caracter hidrofóbico apresentado pela camada superior foi essencial para evitar a infiltração de microrganismos (Staphylococcus aureus (S. aureus) e Escherichia coli (E. coli)). Por outro lado, a incorporação de Aloe Vera nas nanofibras de CS permitiu a produção de uma camada inferior capaz de providenciar um ambiente húmido ao local da lesão, e ainda promover uma melhor e mais rápida adesão/proliferação dos fibroblastos. Além disso, o crescimento de microrganismos na parte inferior da membrana foi inibido devido às propriedades antimicrobianas do CS e do Aloe Vera. No segundo estudo realizado, foram exploradas as propriedades da SF na produção de membranas assimétricas à base de nanofibras, nas quais foi incorporada uma biomolécula (THY), com vista a melhorar o processo de cicatrização de feridas. A SF foi selecionada para este estudo tendo em conta que é uma proteína fibrosa, a qual apresenta excelente biocompatibilidade, biodegradabilidade e força mecânica. A camada superior da membrana foi produzida com uma mistura de PCL/SF com o intuito de obter uma camada com propriedades mecânicas semelhantes à epiderme. Por outro lado, para obter uma camada inferior que reproduza a derme, a SF foi combinada com o HA. A combinação destes compostos permitiu obter uma camada capaz de absorver o exsudado, bem como promover a adesão e proliferação celular. Adicionalmente, o THY foi incorporado nas nanofibras da camada inferior, para lhe conferir propriedades antibacterianas e antioxidantes. Os resultados obtidos mostraram que a camada superior da membrana assimétrica possui uma baixa porosidade, o que lhe permitiu evitar a infiltração dos microrganismos. Por outro lado, a elevada porosidade da camada inferior é essencial para providenciar um ambiente hidratado ao local da lesão, bem como promover a migração/infiltração das células. Além disso, os ensaios mecânicos evidenciaram que as membranas assimétricas possuem propriedades mecânicas semelhantes às exibidas pela pele nativa. Os ensaios in vitro demonstraram ainda que os fibroblastos humanos aderiram e proliferaram na superfície das membranas. A incorporação do THY na camada inferior conferiu propriedades antioxidantes e antibacterianas à membrana produzida. No terceiro estudo apresentado nesta tese foi produzido, através da combinação da técnica de electrofiação com a impressão 3D, um substituto de pele assimétrico. Neste trabalho além de ter sido usada uma nova combinação de polímeros, foram também utilizadas técnicas diferentes para reproduzir as propriedades/estrutura da epiderme e da derme. Desta forma, a técnica de electrofiação foi utilizada com o intuito de obter uma camada superior composta por uma malha de nanofibras, com excelentes propriedades mecânicas e capacidade de efetuar trocas gasosas. Por outro lado, a camada inferior foi produzida através da impressão 3D de um hidrogel, permitindo assim obter uma estrutura 3D capaz de absorver grandes quantidades de exsudado, bem como promover a migração celular. Os resultados obtidos demonstraram que a camada superior composta por PCL e SS evitou a infiltração de microrganismos (S. aureus e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)), e apresentou excelentes propriedades mecânicas semelhantes às exibidas pela epiderme da pele nativa. Em contrapartida, a camada inferior constituída por um hidrogel impresso de CS e alginato de sódio apresentou uma porosidade adequada, hidrofilicidade e as propriedades biológicas necessárias para suportar a adesão, migração e proliferação dos fibroblastos. Além disso, as propriedades antimicrobianas do CS foram demonstradas pela capacidade da camada inferior inibir o crescimento de S. aureus e P. aeruginosa. Em suma, os resultados obtidos nos estudos realizados demonstram a versatilidade da técnica de electrofiação para a produção de membranas assimétricas. Esta técnica permite combinar diferentes polímeros naturais/sintéticos, incorporar biomoléculas no interior das nanofibras e, ainda reproduzir as propriedades da epiderme e da derme. No futuro, a performance destas membranas no tratamento de lesões cutâneas poderá ser incrementada através da incorporação de biomoléculas/células. O uso de outras técnicas poderá também ser considerado, com o objetivo de produzir estruturas com forma/tamanho adequados à lesão do paciente. Além disso, os ensaios in vivo poderão ainda revelar resultados promissores, que contribuirão para a translação destes substitutos de pele para os ensaios clínicos.engLesões cutâneas - Processo de cicatrização - Electrofiação - Membranas assimétricasLesões cutâneas - Regeneração da pele - Electrofiação - Membranas assimétricasLesões cutâneas - Substitutos de pele - Electrofiação - Membranas assimétricasdoctoral thesis101558414