Sousa, Ângela Maria Almeida deValente, Joana Filipa Abreu PereiraPatrício, Tatiana Marisa FernandesCarvalho, Beatriz da Silva2024-11-202024-07-122024-06-11http://hdl.handle.net/10400.6/14673O cancro do colo do útero afeta muitas mulheres em todo o mundo. Esta doença é principalmente transmitida por via sexual e é causada por uma infeção persistente de papilomavírus humano. O genoma do HPV codifica para várias oncoproteínas, nomeadamente para a E6. Após a infeção por este vírus a E6 liga-se à proteína supressora de tumores p53 e desregula o seu normal funcionamento levando à proliferação descontrolada e formação do tumor. O aumento da prevalência desta doença nos países em desenvolvimento é preocupante. As vacinas de DNA e a terapia génica têm sido estudadas para o tratamento do cancro induzido por este vírus. A terapia génica tem gerado particular interesse, tendo como objetivo transferir genes terapêuticos para células-alvo utilizando um vetor de DNA seguro, estável e eficaz. Os principais desafios associados a estas terapêuticas incluem a suscetibilidade do vetor de DNA à degradação durante a circulação no organismo do paciente, a necessidade de uma entrega direcionada, o processamento eficiente do sistema de entrega no interior da célula e a existência de barreiras intracelulares tais como a membrana celular. Para a tradução clínica da terapia génica, a formulação e a produção em larga escala de vetores de DNA, bem como a sua estabilidade e armazenamento, são importantes. As nanopartículas de fosfato de cálcio (CaP NPs) podem ser uma nova abordagem para a entrega de vetores de DNA na terapia génica, devido à sua elevada biocompatibilidade e biodegradabilidade, tendo sido utilizadas para a regeneração de tecidos, como os ossos e os dentes. Estes sistemas podem encapsular diversas biomoléculas, tais como ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, anticorpos ou fármacos. Além disso, as CaP NPs podem oferecer proteção contra a difusão imediata ou a degradação no ambiente circundante, permitindo a libertação controlada de fármacos e a terapia sustentada. Devido às suas características, CaP NPs constituem um vetor não viral promissor para a terapia génica direcionada ao cancro do colo do útero. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e caraterizar CaP NPs para a libertação de DNA plasmídico (pDNA) que codifica para a p53 em células de cancro do colo do útero. As CaP NPs foram sintetizadas utilizando um protocolo de biomineralização com citrato como agente estabilizador e regulador do crescimento de cristais de hidroxiapatite. Os sistemas foram totalmente caracterizados para determinar o seu tamanho, carga, composição química, eficiência de encapsulação e libertação de pDNA. Foram efetuados ensaios in vitro de internalização celular e de citotoxicidade, utilizando linhas celulares de adenocarcinoma cervical (HeLa) e de fibroblastos. Também foi desenvolvido um breve estudo preliminar sobre a funcionalização de CaP NPs com o ligando de biotina. Através de testes de caraterização, as CaP NPs obtiveram um tamanho de 76.34 ± 34.08 nm, com um índice de polidispersidade (PdI) de 0.40 ± 0.09 e uma carga superficial de – 20.90 ± 0.90 mV. Inicialmente, a inclusão do pDNA foi efetuada através de uma abordagem de adsorção, obtendo-se um tamanho de 133.13 ± 58.12 nm, um PdI de 0.65 ± 0.17 e uma carga superficial de – 23.70 ± 1.10 mV. Através da análise FTIR, é colocada a hipótese da presença de pDNA nas NPs de CaP/pDNA, devido à elevada intensidade e ao modo de vibração mais amplo em torno da zona de 1000 cm-1 , em comparação com o espetro das CaP NPs. Obteve-se também uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 100%. Foram executados estudos de transfecção, in vitro, em células HeLa e fibroblastos. Os estudos de viabilidade demonstraram a ausência de citotoxicidade das CaP NPs. No entanto, NPs com pDNA encapsulado em contacto com células têm um pouco efeito na sua citotoxicidade. Com base nestes resultados, foi necessário otimizar a quantidade de pDNA encapsulado. Neste sentido, foram desenvolvidos novos testes de caraterização e obteve-se valores de tamanho de 122.65 ± 8.41 nm, um PdI de 0.26 ± 0.01 e carga superficial de - 19.26 ± 0.80 mV com uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 88%. Foram efetuados novos testes in vitro, que mostraram um ligeiro aumento da citotoxicidade das CaP NPs carregadas com pDNA. A sua internalização foi verificada por microscopia confocal. Posteriormente, para funcionalizar estas nanopartículas, foi incluído na formulação um ligando, a biotina. A formulação obtida com biotina introduzida na solução de fosfato, resultou num tamanho de 221 ± 11.31 nm, um PdI de 0.23 ± 0.01 e uma carga superficial de - 13.79 ± 2.34 mV. Enquanto a formulação em que a biotina foi adsorvida, obteve um tamanho de 120.9 ± 10.75 nm, um PdI de 0.31 ± 0.05 e - 20.42 ± 1.59 mV de carga superficial. Análises FITR também foram realizadas, contudo não foram conclusivas para decidir qual a melhor formulação para a funcionalização de CaP NPs/pDNA com Biotina. Posteriormente, alguns estudos in vitro foram realizados para avaliar que método de funcionalização de NPs com biotina é mais adequado. A citotoxicidade em células cancerígenas aumentou significativamente quando a formulação obtida com biotina introduzida na solução de fosfato entregou o pDNA a células HeLa. A sua internalização foi também verificada através de microscopia confocal. Com base neste estudo, podemos concluir que as CaP NPs são veículos promissores para a entrega de pDNA que expressa o gene p53. No entanto, são ainda necessários mais estudos sobre a funcionalização com a biotina.Cervical cancer affects many women around the world. This disease is mainly sexually transmitted and is caused by a persistent human papillomavirus infection. The HPV genome codes for several oncoproteins, including E6. After infection with this virus, E6 binds to the tumor suppressor protein p53 and disrupts its normal functioning, leading to uncontrolled proliferation and tumor formation. The increase in the prevalence of this disease in developing countries is worrying. DNA vaccines and gene therapy have been studied for the treatment of cancer induced by this virus. Gene therapy has generated particular interest, with the aim of transferring therapeutic genes to target cells using a safe, stable and effective DNA vector. The main challenges associated with these therapies include the susceptibility of the DNA vector to degradation during circulation in the patient's body, the need for targeted delivery, efficient processing of the delivery system inside the cell and the existence of intracellular barriers such as the cell membrane. For the clinical translation of gene therapy, the formulation and large-scale production of DNA vectors, as well as their stability and storage, are important. Calcium phosphate nanoparticles (CaP NPs) could be a new approach for delivering DNA vectors in gene therapy, due to their high biocompatibility and biodegradability, and have been used for regenerating tissues such as bones and teeth. These systems can encapsulate various biomolecules, such as nucleic acids, proteins, peptides, antibodies or drugs. In addition, CaP NPs can offer protection against immediate diffusion or degradation in the surrounding environment, allowing for controlled drug release and sustained therapy. Due to their characteristics, CaP NPs constitute a promising non-viral vector for gene therapy targeting cervical cancer. Therefore, this study aimed to develop and characterize CaP NPs for the delivery of plasmid DNA (pDNA) coding for p53 into cervical cancer cells. The CaP NPs were synthesized using a biomineralization protocol with citrate as a stabilizing agent and regulator of hydroxyapatite crystal growth. The systems were fully characterized to determine their size, charge, chemical composition, encapsulation efficiency and pDNA release. In vitro cell internalization and cytotoxicity tests were carried out using cervical adenocarcinoma (HeLa) and fibroblast cell lines. A brief preliminary study was also carried out on the functionalization of CaP NPs with the biotin ligand. Through characterization tests, the CaP NPs obtained a size of 76.34 ± 34.08 nm, with a polydispersity index (PdI) of 0.40 ± 0.09 and a surface charge of - 20.90 ± 0.90 mV. Initially, pDNA inclusion was carried out using an adsorption approach, obtaining a size of 133.13 ± 58.12 nm, a PdI of 0.65 ± 0.17 and a surface charge of - 23.70 ± 1.10 mV. By FTIR analyses it is hypothesized the presence of pDNA in CaP NPs/pDNA, due to the high intensity and broader vibration mode around 1000 cm-1 zone, compared to the spectrum of CaP NPs. An encapsulation efficiency of approximately 100% was also obtained. In vitro transfection studies were carried out on HeLa cells and fibroblasts. Viability studies showed that CaP NPs were not cytotoxic. However, NPs with encapsulated pDNA in contact with cells have little effect on their cytotoxicity. Based on these results, it was necessary to optimize the amount of encapsulated pDNA. To this end, new characterization tests were carried out and obtained size values of 122.65 ± 8.41 nm, a PdI of 0.26 ± 0.01 and a surface charge of - 19.26 ± 0.80 mV with an encapsulation efficiency of approximately 88%. New in vitro tests were carried out which showed a slight increase in the cytotoxicity of CaP NPs loaded with pDNA. Their internalization was verified by confocal microscopy. Subsequently, to functionalize these nanoparticles, biotin, was included in the formulation. The formulation obtained with biotin introduced into the phosphate solution resulted in a size of 221 ± 11.31 nm, a PdI of 0.23 ± 0.01 and a surface charge of - 13.79 ± 2.34 mV. The formulation in which biotin was adsorbed had a size of 120.9 ± 10.75 nm, a PdI of 0.31 ± 0.05 and a surface charge of - 20.42 ± 1.59 mV. FITR analyses were also carried out, but they were not conclusive in deciding on the best formulation for functionalizing CaP NPs/pDNA with Biotin. Subsequently, some in vitro studies were carried out to assess which method of functionalizing NPs with biotin is most suitable. Cytotoxicity in cancer cells increased significantly when the formulation obtained with biotin introduced into the phosphate solution delivered the pDNA to HeLa cells. Its internalization was also verified using confocal microscopy. Based on this study, we can conclude that CaP NPs are promising vehicles for the delivery of pDNA expressing the p53 gene. However, further studies on functionalization with biotin are still needed.engTerapia GénicaBiotinaCancro do Colo do ÚteroNanopartículas de Fosfato de CálcioP53Pdnamaster thesis203721055