Silvestre, Samuel MartinsBrito, Vanessa Sofia Figueiredo de2018-08-282018-08-282016-7-52016-6-6http://hdl.handle.net/10400.6/5810The enzyme steroid 5a-reductase (5AR) is responsible for the NADPH-dependent reduction of testosterone to the androgen 5a-dihydrotestosterone (DHT). The abnormally high 5AR activity in humans results in excessively high DHT levels in peripheral tissues, which has been mainly implicated in the pathogenesis of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BHP). Therefore, the role of DHT had contributed to the interest in finding 5AR inhibitors. Accordingly, several steroidal and non-steroidal inhibitors have been synthesized and tested against 5AR enzymes. Finasteride is a semi-synthetic 4-azasteroid and it was the first 5AR type II inhibitor approved for the treatment of BHP. In addition, it was also demonstrated that dutasteride acts as a 5AR type I and type II inhibitor and turosteride is selective for the type II isoform of this enzyme. Since these compounds have low potency and produce side effects, it becomes necessary to develop more potent and safe compounds. In the present work, several novel 4-azasteroid derivatives were synthesised from testosterone and progesterone, considering the pharmacophore which finasteride, dutasteride and turosteride have in common. Additionally, to introduce a bulky group and improve the affinity to the enzyme, through an aldol condensation reaction, an aldehyde was added in 16-C and 21-C positions of testosterone and progesterone, respectively. The cell proliferation effects of these compounds was evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide proliferation assay in NHDF, LNCaP and T47D cell lines, In addiction, the cell viability effects was also analyzed using propidium iodide staning in LNCaP cells. In order to understand the affinity of the new compounds to the 5AR enzyme, molecular docking studies were performed. However, as the 3D structural coordinates of 5AR are not available, the docking studies have to be performed with 5ß-reductase (5BR) enzyme. Docking simulations with androgen receptor, estrogen receptor and CYP17A1 were also accomplished. To evaluate the toxicity of compounds, in silico toxicity studies were realized. In conclusion, the new compounds were successfully obtained in reasonable global yields. Molecular docking results support the information relative to the 5AR inhibition and show that the majority of the novel compounds have a high affinity to 5BR, while a less number of compounds presented low binding energies for the other studied receptors. From in silico toxicity studies, the data showed that compounds with furan substituent, after metabolized, can cause tumorigenic and mutagenic effects. Compound 16-[(4-methylphenyl)methylideny)-4-azaandrost-5-ene-3,17-dione, 6b, is the most promising compound, having a behaviour in LNCaP cell line very similar to which was observed with finasteride and show a lower IC50 than this approved drug in these experimental conditions.A próstata humana pretence ao sistema reprodutor masculine, e na idade adulta, assemelha-se, tanto o no tamanho como na forma, a uma castanha. A glândula prostática é um órgão sensível a androgénios e, como tal necessita de androgénios e recetores de androgénios específicos para o normal desenvolvimento: crescimento e função. A hiperplasia benigna da próstata (HBP) é uma das doenças mais comuns nos homens de idade adulta e a sua prevalência tende a aumentar com a idade. De facto, as estimativas sugerem que a incidência desta patologia aumenta de 51% em homens de 50 anos para mais de 88% em homens com 90 anos de idade. Esta doença, tal como o nome indica, está relacionada com a proliferação celular da próstata, mais especificamente no estroma e no tecido epitelial, o que leva a um alargamento benigno da glândula prostática. Deste modo, surgem sintomas no trato urinário inferior nos homens mais velhos, sendo então necessário algum tipo de tratamento. A enzima 5a-redutase (5AR) é responsável pela redução inconversível da testosterone a 5a-dihidrotestosterona (DHT) que é dependente do correspondente cofactor fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina. Um défice de 5AR nos homens resulta numa incompleta diferenciaçãos dos orgãos genitais externos, no nascimento. Por outro lado, aquando do excesso da actividade desta enzima nos humanos, a quantidade de DHT, por consequência, será aumentada nos tecidos periféricos. Tal facto tem sido associado à patogénese do cancro da próstata e na HBP. Este relevante papel fisiopatológica da DHT tem contribuído para o grande interesse na procura de inibidores da 5AR. Deste modo, vários compostos inibidores esteroides e não-esteroides têm sido sintetizados e a sua actividade inibitória da enzima 5AR tem sido testada. Destes compostos, destaca-se a finasterida que é um 4-azaesteroide semi-sintético e o foi o primeiro composto inibidor da 5AR tipo II aprovado para o tratamento da HBP. Além desta molécula, foi igualmente demonstrado que o composto dutasterida atua como inibidor da 5AR tipo I e tipo II e o composto turosterida revelou ser um inibidor seletivo da isoforma tipo II da enzima de interesse. Todavia, como estas moléculas apresentam relativa baixa potência e provocam vários efeitos secundários, torna-se necessário desenvolver compostos mais potentes e mais seguros. No presente trabalho, vários novos derivados de 4-azaesteroides foram sintetizados, utilizando como compostos de partida a testosterona e a progesterona. Esta síntese foi desenhada considerando o farmacóforo comum aos compostos de referência: finasterida, dutasterida e turosteride. Além da lactama no anel A, ao anel D (posições 16-C da testosterona e 21-C da progesterona) do esteroide foi adicionado um aldeído através de uma condensação aldólica, em condições básicas. Tal adição tem o propósito de aumentar a área de contacto entre o composto e a enzima e, por conseguinte, aumentar a afinidade do mesmo. Todos os compostos foram devidamente caracterizados através de ressonânica magnética núclear, espectroscopia de infravermelhos e determinação do ponto de fusão. Além desses métodos, os compostos novos sintetizados foram caracterizados por espectroscopia de massa de alta resolução. Com o objectivo de avaliar a viabilidade celular após exposição aos compostos sintetizados, foram realizados ensaios com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) e de citometria de fluxo com marcação de iodeto de propídeo (IP). No que diz respeito ao ensaio de proliferação celular com MTT, primeiramente procedeu-se a um ensaio de screening para cada linha celular utilizada: células cancerígenas da próstata (LNCaP), da mama (T47D) e células normais da pele (NHDF). A concentração utilizada para todos os compostos, incluíndo para a finasterida, foi de 30 µM e prodedeu-se a um período de incubação de 72h. Após a constatação de quais os compostos com ação antiproliferativa marcada (percentagem de proliferação celular <50% relativamente ao controlo), procedeu-se a ensaios para determinar a curva concentração-resposta. Para tal, foram utilizadas seis concentrações distintas: 0,01, 0,1, 1, 10, 50 e 100 µM e o período de incubação foi igualmente de 72h. Para a determinação dos IC50 recorreu-se ao fitting da curva sigmoidal. Relativamente ao ensaio de citometria de fluxo com marcação de IP, este foi realizado após exposição de 24 e 72h aos compostos (6b e 7g). Este estudo foi efetuado na linha cellular LNCaP, dado ser a mais relevante para o alvo em estudo (contém a enzima 5AR). Após os períodos de incubação as células foram observadas ao microscópio e foram capturadas algumas imagens para posterior análise morfológica. Estudos de docking molecular foram igualmente realizados para tentar compreender a afinidade dos produtos de síntese para a enzima alvo. No entanto, as coordenadas 3D da estrutura da 5AR ainda não estão disponíveis, e por esta razão, houve a necessidade de realizar estudos de docking por homologia, utilizando-se, para isso, a enzima 5ß-redutase (5BR). De igual modo, estudos com outras macroméculas conhecidas por terem como substrato esteroides ou por existerem fármacos esteroides que atuem nas mesmas foram efetuados: recetor de androgénios, recetores de estrogénios e CYP17A1. Este estudo foi realizado para perceber se os novos compostos teriam alguma interação e poder detectar potenciais novas moléculas alvo dentro destas duas séries de produtos. Por fim, para avaliar a potencial toxicidade dos compostos, como efeitos mutagénicos, tumorigénicos, irritação e efeitos na reprodução, foram realizados testes in silico. Em suma, os novos compostos foram sintetizados com sucesso, obtendo-se rendimentos globais bastante razoáveis. Os resultados obtidos através do docking molecular suportam a possibilidade dos produtos serem, de facto, inibidores da enzima 5AR sendo que a maioria dos compostos apresenta uma alta afinidade para a proteína 5BR, quando comparada com a molécula de referência. Por outro lado, estas mesma moléculas sintetizadas não apresentam energias de ligação muito significantes para os outros recetores estudados, à exceção do recetor de estrogénios, em que alguns compostos mostram ter alguma afinidade. No que diz respeito aos estudos para avaliar a toxicidade in silico dos produtos de síntese, apenas os compostos em que está presente um anel furano é que revelaram algum risco relativamente aos efeitos mutagénicos e tumorigénicos. Todos os ensaios realizados apontam para que o composto 16-[(4-metilfenil)metilideno)-4-azaandrost-5-ene-3,17-diona (6b) seja o mais promissor, dado que apresenta um comportamento deveras semelhante à molecula de referência, o fármaco aprovado finasterida. Quando comparados os IC50, este produto é possivelmente mais pontente que a finasterida. O ensaio de citometria de fluxo indica também que este composto poderá interferir no ciclo celular, tal como sucede com a finasterida. Como trabalho futuro, terão de ser realizados ensaios de MTT com outras linhas celulares, principalmente com células PC3, células do cancro da próstata não sensíveis a androgénios, bem como em células saudáveis da próstata (Ex: DU145), para assim confirmar se, de facto, os compostos interferem com vias androgénicas. Seria de igual modo pertinente realizar ensaios de citometria de fluxo que visassem o estudo do efeito dos compostos no ciclo celular, sendo bastante relevante testar o composto 6b. Por fim, a avaliação da inibição enzimática da 5AR é essencial para validar o presente trabalho. Contudo, esta enzima não se encontra disponível na sua forma pura e assim, será necessário recorrer a métodos indiretos, nomeadamente o ensaio colorimétrico com cloreto de tetrazólio nitroazul e quantificação de testosterona e DHT por cromatografia líquida de alta eficiência.eng4-AzaesteroidesCancro da Próstata.Hiperplasia Benigna da PróstataInibidores da 5a-Redutasemaster thesis201774984