Correia, Ilídio Joaquim SobreiraMoreira, André FerreiraRodrigues, Ana Carolina Félix2024-07-042024-05-16http://hdl.handle.net/10400.6/14443Cancer remains one of the most diagnosed and deadliest diseases worldwide. The currently available cancer treatments, such as surgery, chemotherapy, and radiotherapy present low therapeutic efficacies and selectivity toward cancer cells, inducing several side effects. Particularly, the chemotherapeutic agents are characterized by high non-specific toxicity, and low solubility, being rapidly degraded or eliminated from blood circulation. Therefore, there is an urgent and increased need to develop new anti-cancer approaches with greater therapeutic efficacy, selectivity, and safety. In past years, nanoparticles’ application in medicine triggered a new era of cancer research, from diagnostic to therapeutic. These nanosystems can encapsulate drugs, prevent their premature degradation, and promote the drug's specific delivery to the target site. In addition, researchers have also developed nanosystems capable of mediating a photothermal effect in response to near-infrared (NIR; 700-1100 nm) light, as well as, promoting a tumor-specific delivery of the chemotherapeutic agents. In fact, photothermal therapy (PTT) mediated by nanomaterials has been explored as a standalone or combinatorial therapy, focusing on the hyperthermia of the tumor tissue, and avoiding damage in healthy tissues. PTT take advantage of the nanomaterials’ physicochemical properties, which confer them an intrinsic capacity to accumulate at the tumor site, by taking advantage of the defective vasculature of the tumor (e.g., the enhanced permeability and retention (EPR) effect and/or vascular bursts). Thus, under NIR irradiation of the tumor tissue, the accumulated’ nanoparticles can induce a localized hyperthermia which in turn can sensitize cancer cells to other therapeutic approaches (e.g., chemotherapy) or induce several cellular damages that can ultimately lead to cancer cells’ apoptosis or necrosis. Among the different nanostructures developed so far, gold-core mesoporous silica shell (AuMSS) nanorods have been widely explored for cancer therapy application due to their unique physical and chemical properties, that support their simultaneous application as imaging (e.g., computed tomography) and therapeutic agents (e.g., drug delivery and PTT). The anisotropic morphology of the gold core confers to AuMSS nanorods an inherent capacity to present high absorption in the NIR region, and consequently mediate a photothermal effect. Additionally, the inclusion of a mesoporous silica shell provides a biocompatible, inert, and large surface area that can be easily functionalized; tubular pores that improve the particle's ability to encapsulate and deliver bioactive molecules; protection and stabilization of the gold core from photodegradation when exposed to energetic radiations (e.g., NIR light). Despite all the efforts and several studies showing the huge potential of nanomedicines to act as drug delivery platforms and induce cancer cells death both in vitro and in vivo, the treatment of human tumors with this technology has led to modest improvements. In fact, only 0.7% of the injected nanoparticles dose effectively reaches the tumor site, hindering their real therapeutic potential. Thus, this suboptimal pharmacokinetic profile is pointed out as one of the main factors for the reduced therapeutic effectiveness of nanomedicines and their poor translation to clinical practice. Systemic administration is the main route of nanomedicines’ administration in cancer therapy applications. However, upon intravenous administration nanoparticles are highly susceptible to the adsorption of plasma proteins on their surface. Such protein corona can induce several modifications in the nanomedicines' initial physicochemical properties (e.g., immunogenicity, aggregation state, hydrodynamic size, surface chemistry), that will impact their blood retention, bioavailability, tumor accumulation, and even their biosafety. Therefore, there is a consensus that the first step to increase the nanoparticles’ accumulation in the tumor tissue should encompass the optimization of the nanoparticles’ pharmacokinetics, starting with the blood circulation time, which is crucial to increase the chances of their accumulation in the tumor tissue and exert their therapeutic effect. In recent years, different strategies have been developed to improve nanoparticles’ circulation time, mainly by the optimization of their physicochemical properties and/or functionalization with hydrophilic polymers or biomimetic coatings. In fact, due to the non-immunogenicity, biocompatibility, and biodegradability of hydrophilic polymers, they can resist to non-specific protein adsorption and cell adhesion, which significantly attenuates immune system recognition, improving the pharmacokinetic profile. Particularly, biomimetic coatings based on cell-derived vesicles are an emerging concept to improve the nanomaterials’ biological performance. These cell-derived vesicles inherit the unique features of the source cells, such as biocompatibility, long circulation time, homologous targeting, and immune evasion, showing a high potential to create novel and more effective cancer therapies. In this way, the main goal of this Doctoral thesis work plan was to develop and validate the potential of AuMSS nanorods functionalized with polymeric and biomimetic coatings to improve their applicability in chemo-photothermal combinatorial therapy of cancer. This Doctoral thesis includes an introduction section (Chapter 2) where the AuMSS nanorods general properties and application in cancer therapy are discussed. Moreover, an overview of nanoparticles' role in cancer therapy, particularly the impact of physicochemical properties and surface functionalization in nanoparticles’ blood circulation and tumor accumulation. Furthermore, this thesis includes two chapters presenting the research work developed during this doctorate. In the first study (Chapter 3), branched polyethylenimine (PEI) and hyaluronic acid (HA) were combined, for the first time, to functionalize AuMSS nanorods and create a tumor-targeted chemo-photothermal nanomedicine. AuMSS nanorods were produced using the “seed-mediated growth” and Stöber’s modified methods to obtain the gold nanorod core and mesoporous silica shell, respectively. The functionalization of the AuMSS nanorods' surface was achieved through the chemical linkage of PEI (modified with 3-(triethoxysilyl)propyl isocyanate) followed by electrostatic adsorption of HA. The inclusion of PEI and HA on the AuMSS surface promoted a controlled and sustained release of the chemotherapeutic agent – acridine orange (AO). HA functionalization promoted a neutralization of AuMSS surface charge (from 44 to -10 mV) and consequently improved the AuMSS’ biocompatibility by decreasing the blood hemolysis to safe levels. The in vitro assays demonstrated that the HA functionalization increased the nanoparticles’ internalization by cervical cancer cells. Additionally, the combinatorial treatment (i.e., chemotherapy and PTT) mediated by AuMSS/PEI/HA_AO nanorods presented an enhanced effect when compared to single PTT or chemotherapy regiments, leading to the almost complete elimination of the cancer cells (95%). In the second study (Chapter 4), PEI and Red blood cells (RBC)-derived membranes were combined for the first time to functionalize AuMSS nanorods. The RBC-derived membranes were further loaded with AO to allow the combined chemo-photothermal therapy of cervical cancer cells. PEI was chemically modified with 3-(triethoxysilyl)propyl isocyanate, to enable its grafting on the AuMSS nanorods, followed by the entrapment on RBC-derived membranes. PEI/RBC-derived membranes promoted a neutralization of AuMSS surface charge (-26 to -16 mV) and consequently improved the AuMSS nanorods’ colloidal stability and biocompatibility. Also, the AuMSS/PEI/RBC nanorods induced a photo-induced heat variation (ΔT ≈30°C) under NIR irradiation (808 nm, 1.7 W/cm2, 10 min). The in vitro uptake studies revealed that PEI/RBC-derived membranes’ functionalization improved the nanoparticles’ cellular internalization. Furthermore, the combinatorial chemo-PTT mediated by AuMSS/PEI/RBC_AO nanorods eliminated cervical cancer cells, in contrast to less efficient standalone therapies. Overall, the results obtained herein demonstrated that AuMSS nanorods functionalization with hydrophilic polymers (PEI and HA) or biomimetic coating (RBC-derived membranes) improved nanoparticles’ surface charge and colloidal stability, yielding nanomedicines with enhanced biological properties and therapeutic performance. Furthermore, these results support the therapeutic potential of AuMSS nanorods as multifunctional nanomedicines in cancer therapy and highlight that their therapeutic potential can be improved by combining different therapeutic approaches (i.e., chemotherapy and PTT). Altogether, these results reinforce the great potential of AuMSS nanorods, encouraging their continuous study and optimization. This will allow the development of increasingly precise and personalized anticancer therapies, in order to accelerate the translation of AuMSS nanorods into clinical practice, and thus be able to effectively contribute to the treatment of cancer and the reduction of the mortality rate associated with this disease.O cancro continua a ser uma das doenças com maior morbidade e mortalidade em todo o mundo. A cirurgia, quimioterapia e radioterapia são os tratamentos oncológicos mais aplicados em meio clínico, no entanto estas abordagens terapêuticas apresentam uma baixa eficácia e seletividade para as células cancerígenas, induzindo diversos efeitos secundários. Especificamente, os agentes quimioterapêuticos são caracterizados por uma elevada toxicidade inespecífica e uma baixa solubilidade, sendo rapidamente degradados ou eliminados da circulação sanguínea. Desta forma, há uma necessidade urgente e crescente de desenvolver novas abordagens anticancerígenas, que apresentem uma maior seletividade, segurança e eficácia terapêutica. Nos últimos anos, a aplicação das nanopartículas na medicina criou uma nova era na investigação do cancro, desde o diagnóstico à terapêutica. Estes nanossistemas têm a capacidade de encapsular fármacos, prevenir a sua degradação prematura e promover a sua entrega específica no local alvo. Em particular, os investigadores têm vindo a explorar nanomateriais capazes de mediar um efeito fototérmico em resposta à luz de infravermelho próxima (NIR - do inglês near-infrared; 700-1100 nm), promovendo uma entrega específica dos agentes terapêuticos no tumor. De facto, a terapia fototérmica (PTT - do inglês photothermal therapy) mediada por nanomateriais tem sido explorada como terapia única ou combinatória, focando-se na hipertermia do tecido tumoral e na redução de danos nos tecidos saudáveis. A PTT tira partido das propriedades físico-químicas dos nanomateriais, que lhes conferem uma capacidade inata de acumulação no tumor, devido à sua vasculatura anormal (i.e., o efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR) e/ou erupções dinâmicas (do inglês vascular bursts)). Assim, quando o tumor é irradiado com luz NIR, as nanopartículas nele acumuladas podem induzir uma hipertermia localizada que pode sensibilizar as células a outras terapêuticas (por exemplo, quimioterapia) ou induzir diversos danos celulares que podem, em última instância, levar à apoptose ou necrose das células cancerígenas. Entre os diferentes nanomateriais responsivos à luz NIR desenvolvidos até ao momento, os nanobastões de ouro revestidos com sílica mesoporosa (AuMSS - do inglês gold core silica shell nanorods) têm sido amplamente estudados para aplicação na terapia do cancro, devido às suas propriedades físico-químicas únicas, que suportam a sua aplicação simultânea como agentes de bioimagem (por exemplo, tomografia computadorizada) e terapêuticos (por exemplo, entrega de fármacos e PTT). A morfologia anisotrópica do núcleo de ouro confere aos nanobastões de AuMSS uma elevada absorção na região NIR, e consequentemente a capacidade de mediarem um efeito fototérmico. Além disso, o revestimento do núcleo de ouro com a sílica mesoporosa, proporciona às nanopartículas AuMSS uma elevada área de superfície, biocompatibilidade, facilidade de funcionalização, e contribui para a sua estabilidade físico/química; poros tubulares que aumentam a capacidade das nanopartículas de encapsularem e entregarem moléculas bioativas; e ainda contribui para proteção do núcleo de ouro da fotodegradação quando exposto a radiações energéticas (por exemplo, luz NIR). Apesar de vários estudos demostrarem o enorme potencial das nanopartículas para atuarem como agentes de entrega de fármacos e de induzirem a morte de células cancerígenas, tanto in vitro como in vivo, a aplicação destes sistemas no tratamento de tumores humanos tem apresentado resultados modestos. Apenas 0,7% da dose de nanopartículas que é administrada atinge efetivamente o tumor, dificultando que estas exerçam o seu potencial terapêutico. De facto, este perfil farmacocinético é apontado como um dos principais fatores para a reduzida eficácia terapêutica das nanopartículas e para a sua baixa translação para a prática clínica. Após administração intravenosa, as nanopartículas são altamente suscetíveis à adsorção de proteínas plasmáticas à sua superfície. Esta corona proteica pode induzir diversas modificações nas propriedades físico-químicas iniciais dos nanossistemas (por exemplo, imunogenicidade, tamanho hidrodinâmico, química de superfície), que afetarão a sua retenção sanguínea, biodisponibilidade, acumulação tumoral e até mesmo a sua biossegurança. Desta forma, com o intuito de aumentar a acumulação das nanopartículas no tecido tumoral, os investigadores têm procurado otimizar a farmacocinética dos nanossistemas, nomeadamente o seu tempo de circulação sanguínea, de forma a incrementar as chances de acumulação das nanopartículas no tumor e, subsequentemente, exercerem o seu efeito terapêutico. Nos últimos anos, têm sido usadas diferentes estratégias para melhorar o tempo de circulação das nanopartículas. Estas têm-se centrando, na otimização das suas propriedades físico-químicas e na funcionalização da superfície das nanopartículas com polímeros hidrofílicos ou com revestimentos biomiméticos. As propriedades apresentadas pelos polímeros hidrofílicos, como sejam a não-imunogenicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade, permitem aos nanossistemas resistir à adsorção inespecífica de proteínas, o que atenua significativamente o reconhecimento destes pelo sistema imunológico, melhorando assim o seu perfil farmacocinético. Particularmente, os revestimentos biomiméticos baseados em vesículas derivadas de células são um conceito emergente para melhorar o desempenho biológico dos nanomateriais. Estas vesículas possuem as características únicas das células que lhes deram origem, como biocompatibilidade, elevado tempo de circulação, direcionamento homólogo e evasão imunológica, o que demonstra o seu elevado potencial para o desenvolvimento de terapias anticancerígenas mais eficazes. Assim sendo, o principal objetivo do plano de trabalhos desta tese de doutoramento foi desenvolver e validar o potencial dos nanobastões de AuMSS funcionalizados com revestimentos poliméricos e biomiméticos, de forma a aumentar a sua aplicabilidade na terapia combinatória quimio-fototérmica do cancro. A presente tese de doutoramento inclui uma secção introdutória (Capítulo 2) onde são abordadas as propriedades gerais dos nanobastões AuMSS e a sua aplicação na terapia do cancro. Além disso, é discutido o impacto das propriedades físico-químicas e da funcionalização de superfície no tempo de circulação sanguínea e acumulação tumoral das nanopartículas. Adicionalmente, esta tese inclui dois capítulos centrados no trabalho de investigação desenvolvido durante este doutoramento. No primeiro estudo (Capítulo 3) a polietilenimina ramificada (PEI) e o ácido hialurónico (HA) foram combinados, pela primeira vez, para funcionalizar nanobastões de AuMSS e criar um nanossistema quimio-fototérmico direcionado ao tumor. Os nanobastões AuMSS foram produzidos usando os métodos denominados “seed-mediated growth” e “Stöber’s modified” para obter o nanobastão de ouro e o revestimento de sílica mesoporosa, respetivamente. A funcionalização da superfície dos nanobastões AuMSS foi alcançada através da ligação química do PEI (modificado com 3-(trietoxisilil)propil isocianato), seguida de adsorção eletrostática do HA. A inclusão de PEI e HA na superfície das nanopartículas promoveu uma libertação controlada e sustentada do fármaco quimioterapêutico encapsulado, laranja de acridina (AO - do inglês acridine orange). A funcionalização do HA promoveu uma neutralização da carga de superfície dos nanobastões de AuMSS (de 44 para -10 mV) e consequentemente melhorou a biocompatibilidade dos nanossistemas ao diminuir a hemólise sanguínea para níveis seguros. Os ensaios in vitro demonstraram que a funcionalização do HA aumentou a internalização das nanopartículas pelas células cancerígenas do colo do útero. Além disso, o tratamento combinatório (ou seja, quimioterapia e PTT) mediado pelos nanobastões AuMSS/PEI/HA_AO apresentou um efeito terapêutico potenciado quando comparado à terapia única de PTT ou quimioterapia, levando à eliminação quase completa das células cancerígenas (95%). No segundo estudo (Capítulo 4), o polímero PEI e as membranas derivadas de glóbulos vermelhos (RBC) foram combinados pela primeira vez para funcionalizar os nanobastões de AuMSS. As membranas derivadas de RBC foram posteriormente carregadas com AO para permitir a terapia combinada quimio-fototérmica das células do cancro do colo do útero. O PEI foi quimicamente modificado com 3-(trietoxisilil)propil isocianato, para permitir a sua ligação à superfície dos nanobastões AuMSS, seguida pelo seu aprisionamento em membranas derivadas de RBC. A funcionalização PEI/RBC promoveu uma neutralização da carga de superfície dos nanobastões de AuMSS (-26 a -16 mV) o que consequentemente melhorou a sua estabilidade coloidal e a sua biocompatibilidade. Além disso, os nanobastões AuMSS/PEI/RBC foram capazes de induzir uma variação de temperatura (ΔT ≈30°C) sob irradiação de um laser de luz NIR (808 nm, 1,7 W/cm2, 10 min). Os estudos de internalização in vitro revelaram que a funcionalização PEI/RBC melhorou a internalização celular das nanopartículas. Além disso, a terapia combinada quimio-fototérmica mediada pelos nanobastões AuMSS/PEI/RBC_AO eliminou as células do cancro do colo do útero, em contraste com aplicação única da quimioterapia ou PTT, que mostraram ser menos eficientes. Em suma, os resultados obtidos no trabalho experimental, realizado ao longo desta tese de doutoramento demonstraram que a funcionalização dos nanobastões AuMSS com polímeros hidrofílicos (PEI e HA) ou revestimento biomimético (membranas derivadas de RBC) melhoraram a carga superficial e a estabilidade coloidal das nanopartículas, o que permitiu a produção de nanossistemas com propriedades biológicas e desempenho terapêutico aprimorados. Além disso, estes resultados suportam o potencial terapêutico dos nanobastões AuMSS como nanossistemas multifuncionais na terapia do cancro, destacando que o seu efeito terapêutico pode ser melhorado pela combinação de diferentes abordagens terapêuticas (ou seja, quimioterapia e PTT). Adicionalmente, estes resultados encorajam ao contínuo estudo e otimização dos nanobastões AuMSS, de forma a desenvolver terapias anticancerígenas cada vez mais precisas e personalizadas. Tal permitirá acelerar a translação destes nanossistemas para a prática clínica, e poderem assim contribuir eficazmente para o tratamento do cancro e redução da taxa de mortalidade associada a esta doença.engCancroNanopartículas de ouro com revestimento de sílicaQuimioterapiaTempo de circulação sanguíneaTerapia combinatóriaTerapia fototérmicaVesículas derivadas de célulasBlood circulation timeChemotherapyPhotothermal therapydoctoral thesis101630158