Granadeiro, Luiza Augusta Tereza Gil BreitenfeldCosta, Aldo Filipe Matos Moreira Carvalho daCrisóstomo, Luís Daniel Machado2013-09-252013-09-252013-06http://hdl.handle.net/10400.6/1340Physical exercise have several health benefits, but it can also be a source of cellular damage. The energetic demands of physical exercise and training promote an increase on metabolic rate, and its pathways may produce secondary harmful compounds that will cause cellular damage. Some of those compounds are the free radicals and Reactive Oxygen species, which are highly instable molecules that react quickly, oxidizing important functional molecules such as proteins, membrane lipids and DNA, in a condition known as oxidative stress. To dampen the action of these molecules, the cells express antioxidant defence proteins. One of the most ubiquitous and polymorphic of those is the family of Gluthatione STransferases (GSTs). The great physical load of competitive training creates serious oxidative stress on athletes so, it is expected that their expression of GSTs will vary throughout the season to overcome such aggression, quickly recovering from one training session and preparing the antioxidant defence for the next one. Our main objective was to verify if the expression of a GST (GSTT1) varies throughout the season, as expected theoretically, and how it fluctuates after a competition. We also check if the distribution of the GSTM1 and GSTT1 Null/Present genotypes had some influence in the preparation and performance of our sample, consisting in 20 national level swimmers. A control group of 52 random individuals was also used to compare genotype distribution. We collected blood samples in analytic filter paper, at 5 different moments throughout the winter season. DNA was isolated from a sample of each individual, amplified by PCR for our interest genes, and ran in agarose gel by electrophoresis to genotype our 20 swimmers. RNA was isolated from all the samples of a swimmer and converted in cDNA by reverse transcriptase. The relative expression of GSTT1 was done using β-actin (a housekeeping gene) as a control gene and the first collected sample of the swimmer as control condition, by the RT-PCR technic. Three swimmers were accessed for the whole 5 moments, while eight were only evaluated their expression at 48h and 72h after competition. The results showed little influence in the distribution of genotype from swimmers to controls. The expression results show influence of the GSTT1 expression profile throughout the season and after an intense exercise with sport performance and as a fitness check tool.O treino desportivo com o objetivo de performance competitiva coloca os atletas sob um forte risco de desequilíbrio oxidativo, conhecido por stress oxidativo. A produção de radicais livres e espécies electrofílicas, como as Espécies Reativas de Oxigénio (ROS), são uma constante no metabolismo normal do organismo, no entanto, a maior taxa metabólica exigida pela demanda energética do exercício físico intenso, provocam uma produção de tais espécies a um nível superior às defesas antioxidantes disponíveis. Nesta situação de stress oxidativo, os radicais livres e ROS provocam danos a fulcrais estruturas e macromoléculas celulares, reagindo forte e rapidamente com estas, ameaçando a homeostasia celular. Para controlar a ação nefasta dessas agressões oxidativas, os organismos possuem mecanismos de defesas antioxidantes, podendo estas ser de origem endógena ou exógena. Entre as defesas antioxidantes endógenas encontram-se proteínas expressas pelas células, e cuja expressão pode ser influenciada pelo ambiente oxidativo celular, como é o caso das Glutationa S-Transferases (GST). Desta forma, situações que criem stress oxidativo, como no treino desportivo, ativam a expressão das defesas antioxidantes. Assim sendo, o treino desportivo regular e bem planeado, de forma a evitar danos constantes ao organismo, deve ativar uma resposta deste de forma a protege-lo dessa agressão, preparando-o previamente para essa agressão. Essa preparação pode ser verificada através da expressão génica de fatores antioxidantes endógenos. Além disso, certos genótipos podem revelar-se vantajosos nesta proteção, nomeadamente os genótipos associados às várias isoformas das GSTs. Nestes, constam vários e frequentes genótipos Null (ausência do gene), o que permite uma grande variabilidade entre indivíduos para a disponibilidade de isoformas de GSTs. O objetivo deste trabalho foi precisamente verificar a distribuição de genótipos Null/Present para duas isoformas de GSTs, a GSTM1 e a GSTT1, numa amostra de 20 nadadores portugueses de nível nacional. Para comparação de genótipos, foi recolhida semelhante informação a partir de um grupo de controlo constituído por 52 indivíduos aleatórios. Além disso, observou-se a expressão relativa de GSTT1 ao longo de 5 momentos distintos ao longo da época de Inverno (preparação geral, preparação específica, fase taper e dois momentos pós-competição) em 3 desses atletas, e a expressão relativa, também de GSTT1, 48h e 72h após uma competição, para 8 desses atletas. Para conseguir alcançar isto, foi necessário montar uma técnica totalmente nova para recolher as amostras de forma rápida, fiável e praticável nas condições de treino, e otimizar todos os procedimentos laboratoriais para conseguir processar essas amostras de forma eficiente e rigorosa. As amostras foram recolhidas em papel de filtro de análises clínica, através de uma picada no dedo dos nadadores, antes do início do treino do dia definido previamente para recolha de amostras. As amostras foram ainda conservadas em invólucros individuais para cada recolha a cada momento e de cada atleta, numa câmara-fria 4°C, no Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS) da Faculdade de Ciências da Saúde (FCS) da Universidade da Beira Interior (UBI). Para genotipagem dos nadadores em amostra, DNA foi extraído da amostra de sangue em papel utilizando o método do Chelex 100. Após extração, o DNA foi usado para amplificação enzimática da sequência específica dos genes da GSTM1 e GSTT1, pela técnica de PCR. Por fim, os resultados foram corridos por electroforese em gel de agarose, usando Green-safe como fator de marcação de DNA, e os resultados foram visualizados à luz ultravioleta num transiluminador. A presença de GSTM1 foi identificada pela presença de uma banda com cerca de 215bp, enquanto a presença de GSTT1 foi identificada pela presença de banda aos 473bp. Para análise da expressão génica, RNA foi isolado a partir das amostras de sangue em papel, pelo método do Trizol. O RNA era correspondente a cada um dos momentos de recolha. De seguida o RNA foi convertido a cDNA através da técnica de transcriptase reversa, utilizando a enzima M-MLV. Por fim, o cDNA foi amplificado pela técnica de RT-PCR, para o gene GSTT1, tendo ainda como controlo a amplificação da β-Actin, também para cada um dos momentos de recolha e fazendo duplicados por uma questão de rigor. A expressão foi calculada através das curvas de amplificação de RT-PCR e utilizando o método ΔΔCT. Não foram encontradas distribuições de genótipos GSTM1 e GSTT1 Null/Present estatisticamente significativas entre a nossa amostra de teste e o grupo de controlo. No contexto da expressão relativa de GSTT1, verificou-se que variações muito acentuadas ao longo da época desportiva ou após um exercício foram prejudiciais à performance física dos nadadores. Encontramos também algumas diferenças na recuperação das nadadoras, mantendo uma expressão mais alta e por um maior período de tempo após o exercício físico intenso que os homens. Além disso, verificou-se uma tendência para os indivíduos GSTM1 Null manterem os níveis de expressão relativa de GSTT1, ao longo da época e após um exercício intenso, mais estáveis, o que parece favorecer o seu rendimento. Conclui-se ainda que a análise da evolução da expressão relativa de GSTT1 em vários treinos, após uma competição ou outro exercício de elevada intensidade, pode ajudar a perceber qual a forma atual de um nadador.engGlutationa S-TransferasesStress oxidativo - Treino desportivoEspécies reactivas de oxigénioExpressão génicamaster thesis