Correia, Ilídio Joaquim SobreiraBorges, Paula Isabel Teixeira Gonçalves CoutinhoRibeiro, Maximiano José Prata2016-02-152016-02-152014-10http://hdl.handle.net/10400.6/4011The skin is the largest organ in mammals and acts as a barrier between the human body and the surrounding environment. It protects the underlying organs and defends the body against nocive agents. After an injury, skin integrity is compromised and the organism triggers the wound healing process for restoring the structure and functions of this organ. Wound healing is an extremely dynamic and interactive biological process that involves extracellular matrix molecules, soluble mediators, various resident cells (fibroblasts and keratinocytes) and infiltrating leukocyte subtypes which, together, act to re-establish the integrity of the damaged tissue and replace the lost one. To improve patients odds of survival and to minimize the loss of skin vital functions, this tissue has to be covered immediately after being damaged. Such highlights the importance of developing new wound dressings that improve the healing process, making it less painful and, simultaneously, contributing for the re-establishment of skin structure and functions in a shorter period of time. In recent years, various dressings have been developed, using natural or synthetic materials, for restoring skin native properties and structure. Although, none of them is capable of fully accomplish this objective. Taking this into account, the main objective of this work was to develop and characterize skin substitutes to be used in the treatment of skin disorders. Natural polymers such as agarose, chitosan and dextran were used for dressings production. Initially, we evaluated the applicability of a chitosan hydrogel as a wound dressing. The morphology of the developed system was characterized by scanning electron microscopy while its cytotoxic profile and degradation by-products were evaluated through in vitro assays. In vivo experiments were also performed to evaluate the potential of the chitosan hydrogel for the treatment of skin burns. The results obtained revealed that the hydrogel developed has the required properties for biomedical application intended, once the in vitro and in vivo assays revealed that chitosan hydrogel and its degradation by-products are biocompatible and possess the ability to promote the healing of skin wounds. In the second study, a dextran hydrogel was loaded with chitosan microparticles containing epidermal and vascular endothelial growth factors for the improvement of wound healing process. The hydrogel morphology and cytotoxicity profile and degradation by-products were characterized by scanning electron microscopy and in vitro assays. Furthermore, in vivo experiments were also performed to evaluate the applicability of the hydrogel for wound healing. The results obtained, revealed that the animals treated with this hydrogel showed a faster wound healing with no signs of local or systemic inflammatory response. Moreover, a unique application per week of this skin substitute allowed a faster healing than that obtained when growth factors were topically applied in the wound every two days. Dextran hydrogel proved that it can be used as a wound dressing and also as a carrier of microparticles containing growth factors involved in wound healing. In the third study, a thermoresponsive chitosan/agarose hydrogel was produced for being used in the wound healing process. The porosity, wettability, hydrophilicity, biocompatibility, and bactericidal activity of the hydrogel were characterized by scanning electron microscopy, studies of water uptake, determination of contact angle, confocal microscopy, cytotoxic assays, determination of minimum inhibitory concentration and biofilm deposition, respectively. The performance of this polymeric matrix in the wound healing process was evaluated through in vitro and in vivo assays. The attained results revealed that the hydrogel promotes cellular adhesion and proliferation and also its bactericidal activity. The in vivo studies showed also an improved healing and the lack of a reactive or a granulomatous inflammatory reaction in the skin lesions treated with this hydrogel. During this PhD, various natural polymers were used to produce three different hydrogels, aimed for wound healing. The in vitro and in vivo assays revealed promising results that may allow their use as skin substitutes in a near future.A pele é o maior órgão do corpo humano e protege/defende os órgãos subjacentes de agentes patogénicos ou outros agentes nocivos. Devido à sua localização, estrutura e funções, a pele, está sujeita a agentes térmicos, mecânicos e químicos potencialmente nocivos que lhe podem causar diferentes tipos de lesões. Estas têm uma grande incidência na população mundial e o seu tratamento implica elevados custos associados. Após uma lesão, a integridade da pele fica comprometida obrigando o organismo a desencadear o mecanismo de cicatrização para restabelecer a estrutura e funções deste órgão. Este processo é extremamente dinâmico e biologicamente interativo, envolvendo interações entre moléculas da matriz extracelular, mediadores solúveis e várias células (fibroblastos, queratinócitos e leucócitos), que permitem o restabelecimento da integridade ou a substituição do tecido lesado. De forma a melhorar as hipóteses de sobrevivência dos pacientes e a minimizar a perda de funções vitais da pele, esta tem de ser revestida imediatamente após lesão. Tal necessidade destaca a importância do desenvolvimento de novos revestimentos de pele que melhorem o processo de cicatrização, tornando o menos doloroso, e que simultaneamente, contribuam para o restabelecimento das propriedades nativas da pele num curto período de tempo. Nos últimos anos, têm vindo a ser desenvolvidos diversos substitutos de pele, utilizando materiais naturais ou sintéticos, sendo alguns deles já utilizados em meio clínico. Contudo, até ao momento nenhum deles foi capaz de restabelecer todas as propriedades da pele e as suas estruturas acessórias. Tendo isso em conta, o presente estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento e caracterização de substitutos de pele para o tratamento de lesões da pele. Para este fim foram usados polímeros naturais, nomeadamente o quitosano, o dextrano e a agarose. Numa primeira fase do estudo, avaliou-se a aplicabilidade de um hidrogel à base de quitosano para o revestimento de feridas. O quitosano é considerado um biomaterial versátil com propriedades (elevada biocompatibilidade, biodegradabilidade, hemostático, bactericida e baixa antigenicidade) que permitem a sua utilização em aplicações biomédicas. Inicialmente procedeu-se à caraterização morfológica do hidrogel desenvolvido, através de microscopia eletrónica de varrimento. Posteriormente, avaliou-se o perfil citotóxico e de degradação do hidrogel através de ensaios in vitro. Por último, foram também realizados ensaios in vivo para avaliar o potencial do hidrogel de quitosano no tratamento de queimaduras. Os resultados obtidos revelaram que o hidrogel desenvolvido possui as propriedades necessárias para a aplicação biomédica pretendida, uma vez que os ensaios in vitro e in vivo revelaram que o hidrogel de quitosano e os seus subprodutos de degradação são biocompatíveis e que o mesmo possui capacidade de promover o processo de cicatrização de feridas cutâneas. Posteriormente, foi desenvolvido um hidrogel de dextrano com micropartículas de quitosano carregadas com fatores de crescimento (fator de crescimento vascular endotelial e fator de crescimento epitelial). O dextrano é um polissacárido natural, biocompatível, biodegradável e com elevada versatilidade o que permite a sua utilização na síntese de diferentes hidrogéis. A morfologia do hidrogel produzido foi caracterizada através de microscopia eletrónica de varrimento. Os estudos in vitro permitiram avaliar o perfil de toxicidade e degradação do hidrogel. Subsequentemente ratos Wistar foram usados para caracterizar a aplicabilidade do sistema no tratamento de queimaduras na pele. Os resultados obtidos demonstraram que o hidrogel de dextrano pode ser utilizado como um revestimento de pele e como um veículo para transportar fatores de crescimento, de forma a permitir uma mais rápida cicatrização da ferida, sem que tenham sido observados sinais de resposta inflamatória local ou sistémica. Por outro lado, verificou-se que uma aplicação semanal deste substituto da pele carregado com fatores de crescimento contribuiu para reduzir a área da ferida mais rapidamente do que quando os fatores de crescimento são aplicados na forma livre sobre a ferida, a cada dois dias. Além disso, o hidrogel de dextrano pode ser uma excelente opção para a aplicação em feridas com extremidades irregulares, uma vez que o hidrogel é reticulado in situ e este pode adaptar-se à forma da ferida. Num terceiro estudo, foi desenvolvido um hidrogel termoresponsivo constituído por quitosano e agarose e a sua aplicabilidade no processo de cicatrização de feridas foi caracterizada. A agarose é um polissacárido biocompatível extraído a partir de algas marinhas, com capacidade de produzir géis termoresponsivos. Além disso, tem propriedades físicas, mecânicas e químicas semelhantes às de alguns tecidos do corpo humano. Tais propriedades permitem que ocorra a adesão e proliferação celular na presença deste material. A combinação de quitosano com agarose teve como objetivo explorar as interações poliméricas e o carácter termoresponsivo da agarose na produção de um hidrogel. Neste estudo a porosidade, capacidade de absorção de água, hidrofilicidade, biocompatibilidade e a atividade bactericida do hidrogel foram caracterizadas por microscopia eletrónica de varrimento, determinação do angulo de contacto, microscopia confocal, ensaio de citotoxicidade, determinação da concentração mínima inibitória e formação de biofilmes. Os resultados obtidos revelaram que o hidrogel promove a adesão e proliferação celular e possui atividade antimicrobiana. O desempenho do hidrogel na cicatrização de feridas foi avaliado através de ensaios in vivo, em que se registou que a cicatrização ocorreu num menor período de tempo e que os animais tratados com o hidrogel não evidenciavam qualquer reação inflamatória local ou sistémica. Os diferentes estudos efetuados ao longo do meu doutoramento permitiram a produção/desenvolvimento de diferentes hidrogéis constituídos por polímeros naturais, que se pretendem aplicar na cicatrização de feridas. Os ensaios in vitro e in vivo revelaram resultados promissores que podem permitir a utilização dos hidrogéis desenvolvidos como substitutos de pele num futuro próximo.engSubstituto de pele - CaracterizaçãoSubstituto de pele - Desenvolvimento de revestimentoSubstituto de pele - BiomateriaisHidrogéis - Revestimento de feridasdoctoral thesis101563655