Botelho, Maria Filomena Rabaça RoqueBaptista, Cláudio Jorge MaiaMamede, Ana Catarina Manjolinha2017-09-182017-09-182017-05http://hdl.handle.net/10400.6/4495As propriedades anti-cancerígenas da membrana amniótica humana têm sido investigadas ao longo da última década. Estudos in vitro e in vivo revelaram que as células derivadas da membrana amniótica e meio por ela condicionado poderão vir a ser utilizados na terapia do cancro. O carcinoma hepatocelular representa atualmente uma importante causa de morte em todo o mundo. O transplante hepático e a ressecção cirúrgica por hepatectomia parcial são as únicas opções curativas atualmente disponíveis para o carcinoma hepatocelular em estadio inicial. Devido à assintomatologia da doença, o carcinoma hepatocelular é normalmente diagnosticado numa fase avançada não existindo, para tal, terapêuticas curativas adequadas. Neste caso, a quimioterapia e a radioterapia são frequentemente prescritas com o objetivo de aliviar os sintomas associados à normal progressão da doença. Assim sendo, é urgente descobrir novos agentes terapêuticos que se revelem eficazes contra o carcinoma hepatocelular. Até agora, o efeito da membrana amniótica enquanto tecido não foi investigado na doença oncológica. Por este motivo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de extratos das membranas amnióticas humanas (hAMPE, do inglês human amniotic membrane protein extracts) no cancro humano, particularmente no carcinoma hepatocelular, recorrendo para tal a diversos modelos in vitro e in vivo, bem como a inúmeras técnicas de biologia celular e molecular. Os hAMPE foram capazes de inibir a atividade metabólica de diversas linhas celulares de cancro humano, entre as quais o carcinoma hepatocelular. Estudos pormenorizados revelam que os hAMPE são capazes de inibir a atividade metabólica, o conteúdo proteico e o conteúdo de ácido desoxirribonucleico (ADN) nas células de todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular estudadas, de forma dependente da dose e do tempo de exposição. O tratamento foi capaz de induzir a morte celular sendo, no entanto, a via de morte induzida dependente do perfil particular de cada linha celular. Desta forma, a via intrínseca da apoptose foi estimulada nas células da linha celular HuH7, tal como confirmado pelo aumento da expressão da razão BAX/BCl2, do citocromo C, da caspase 9 e da caspase 3. Por outro lado, a via extrínseca da apoptose foi induzida pelos hAMPE nas células HepG2 e Hep3B2.1-7. Nas células destas linhas celulares, foi registado um aumento da expressão da caspase 3 e da caspase 8. Nas células da linha celular HepG2 foi também observada necrose tumoral. Os hAMPE foram capazes de modificar o microambiente tumoral oxidativo de todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular estudadas, bem como o seu ciclo celular. Neste estudo verificou-se que os hAMPE atuaram de forma diferente a nível dos danos no ADN, da P21, da P53, da β-catenina, das proteínas de multirresistência (MDR, do inglês multidrug resistance) e dos transportadores de glicose (GLUT, do inglês glucose transporters) nas linhas celulares de carcinoma hepatocelular. Os hAMPE parecem surtir um efeito potenciador do 5-Fluouracilo (5-FU), da doxorrubicina, da cisplatina e do sorafenib, apesar da resposta obtida não ser homogénea entre as linhas celulares consideradas. Os resultados in vivo confirmaram, mais uma vez, que o sucesso da terapia com os hAMPE depende do perfil de cada linha celular. Os hAMPE apresentaram citotoxicidade seletiva, uma vez que não foram capazes de inibir a atividade metabólica, o conteúdo proteico e o conteúdo de ADN das células de uma linha celular não tumorigénica. Os resultados obtidos contribuíram para o estudo da terapia anti-cancerígena com recursos às membranas fetais, abrindo novas oportunidades no que à terapia do carcinoma hepatocelular diz respeito. Os nossos resultados sugerem também que as características genéticas e biológicas das linhas celulares são responsáveis pela resposta celular à terapia, tornando claro que as terapias anti-cancerígenas devem ser preferencialmente personalizadas.The anticancer properties of the human amniotic membrane has been investigated over the last decade. In vitro and in vivo studies showed that the amniotic membrane derived cells and their conditioned medium may play an important role in cancer therapy. Currently, hepatocellular carcinoma represents a worldwide major cause of death. Liver transplantation and surgical resection by partial hepatectomy are the only curative options available for early stage hepatocellular carcinoma. Due to the lack of symptoms, hepatocellular carcinoma is usually diagnosed at advanced stage. There are no curative therapies for advanced stage hepatocellular carcinoma. In this case, chemotherapy and radiotherapy are often prescribed in order to relieve the symptoms associated with the normal progression of the disease. For all this reasons, it is urgent to discover new and effective therapeutic agents against hepatocellular carcinoma. Considering that the effect of amniotic membrane as a tissue has not been investigated so far in cancer disease, the aim of this study was to evaluate the effect of human amniotic membrane protein extracts (hAMPE) in human cancer, particularly in hepatocellular carcinoma, using several in vitro and in vivo models, as well as different cellular and molecular biology techniques. hAMPE were able to inhibit the metabolic activity of several human cancer cell lines, including hepatocellular carcinoma. Detailed studies showed that hAMPE were able to inhibit the metabolic activity, protein and deoxyribonucleic acid (DNA) content in all hepatocellular carcinoma cell lines in a dose and time dependent manner. The treatment was able to induce cell death, but the induced death pathway was dependent on the particular profile of each cell line. Thus, the intrinsic apoptosis pathway was stimulated in the cells of the HuH7 cell line, as demonstrated by the increased expression of BAX/BCL2 ratio, cytochrome C, caspase 9 and caspase 3. On the other hand, the extrinsic apoptosis pathway was induced by hAMPE in the Hep3B2.1-7 and HepG2 cells. In these cell lines, there was an increase in the expression of caspase 3 and caspase 8. Regarding HepG2 cell line, tumour necrosis was also observed. The hAMPE were able to modify the oxidative tumour microenvironment in all hepatocellular carcinoma cell lines, as well as their cell cycle. In this study, it was found that hAMPE act differently in the DNA damage, P21, P53, β-catenin, multidrug resistance proteins (MDR) and glucose transporters (GLUT) of all hepatocellular carcinoma cell lines. The hAMPE seems to potentiate the effect of 5-fluorouracil (5-FU), doxorubicin, cisplatin and sorafenib, although the response obtained is not homogeneous across all the cell lines. The in vivo results also suggest that the success of hAMPE therapy depends of each cell line profile. hAMPE presents selective cytotoxicity, since were not able to inhibit the metabolic activity, protein and DNA content of a non-tumorigenic cell line. In conclusion, the results obtained in this study contribute to the anti-cancer therapy study with resource to fetal membranes, opening up new opportunities regarding the hepatocellular carcinoma therapy. In addition, the results also suggest that the genetic and biological characteristics of the cell lines are responsible for the cellular response to therapy, making it clear that the anti-cancer therapies should preferably be personalized.porMembrana amniótica humanaCarcinoma hepatocelular - TerapiaPlacenta - Terapia anti-cancerígenadoctoral thesis101410310