Sousa, Fani Pereira deCorreia, Ilídio Joaquim SobreiraPichon, ChantalGaspar, Vítor Manuel Abreu2016-02-232018-12-312015http://hdl.handle.net/10400.6/4030The prevalence of numerous diseases which are currently responsible for high mortality rates or that affect people well-being is one of the major challenges faced by nowadays society. To improve general health and population quality of life, tremendous efforts have been focused on speeding up the discovery of innovative pharmaceutics for treatment of particularly complex and incurable pathologies such as cancer. Currently, the generally applied anticancer treatments result only in a slight increase in patient survival rates and additional lifetime without disease recurrence. However, these improvements are often short-lived and are associated with severe systemic toxicity that debilitates patients health during treatment. This fact demonstrates the ineffectiveness and reduced safety of clinically administered therapies, and above all, emphasizes the urging necessity to discover more efficient approaches that can promote a better therapeutic outcome with fewer side-effects. From the numerous anticancer treatments currently under development, those based on nonviral gene transfer with nucleic acid-based pharmaceuticals have a great therapeutic potential since they are currently approved for human use by United States Food and Drug Administration (US-FDA) and European Medidicines Agency (EMA) regulatory agencies, can be produced at industrial scale and are highly versatile. In fact, unlike standard cytotoxic drugs, the original structure of DNA biopharmaceuticals can be precisely engineered to encode multiple, tumor suppressor genes which may simultaneously affect cancer cells proliferation, or induce their destruction without direct damage to healthy tissues. In this context, plasmid DNA (pDNA) gene expression cassettes remain the gold standard biopharmaceuticals for gene therapy. However, despite being a promising tool, the widespread use of standard plasmid vectors is restricted by their short-term activity in vivo. Therefore, to realize the full potential of this therapeutic approach other alternatives for transgene expression in humans must be explored. In this context, a recently upgraded technology based on the use of minimalistic gene expression cassettes devoid of the bacterial backbone, so-termed DNA minicircles, has shown to provide the required biological efficiency. Due to the fact that this is a relatively new technology the parameters of mcDNA production in prokaryotic organisms have not yet been correctly explored. The optimization of this bioprocess assumes a critical importance from a manufacture and therapeutic point of view, since various factors may affect the productivity, final stability and purity of mcDNA preparations. A part from these necessary improvements, mcDNA gene transfer to diseased tissues also remains as one the most rate limiting steps in the translation of these therapies from bench-to-bedside, being necessary as well to improve the currently existing technologies for DNA transfer to eukaryotic cells. Taking this background into account, the main hypothesis of this work was to explore and optimize mcDNA biosynthesis, to screen ligands for purification of these vectors and develop biocompatible polymeric nanocarriers for minicircle gene delivery to different in vitro and in vivo cancer models. As an additional remark to this integrative study, the synthesis of stimuli-responsive delivery systems for co-administration of mcDNA-drug combinations to cancer cells was also investigated. Bioprocess optimization was initially performed by studying and manipulating the amplification of template parental plasmids (PP) in an Escherichia coli strain (ZYCY10P3S2T) genetically modified to produce mcDNA from plasmid templates with high efficiency. During these experiments it was hypothesized that the manipulation of bacterial growth temperature could provide important improvements in the quantity of mcDNA produced in later stages of the process. The obtained results indicated that an increase in bacterial growth temperature maximized the amount of template plasmids per biomass. In addition to this enhancement, a real-time monitoring of the PP–to-mcDNA intramolecular recombination process revealed that the time of mcDNA recovery significantly affects both the final yield and also the presence of residual PP and mini-plasmid (mP) species in minicircle preparations. These important findings demonstrate that maximum productivity and pharmaceutical-grade minicircle batches were obtained at specific time points during the induction phase. Having established optimal bioprocess parameters, the use of novel L-arginine dipeptide ligands for mcDNA biopharmaceuticals isolation or purification was investigated. These dipeptide ligands are particularly interesting as they take advantage of biomimetic interactions that are naturally established between amino acids and DNA in vivo. As a proof-of-concept, mcDNA vectors and PP template plasmids were injected into microfluidic chips containing chemically immobilized dipeptides. The sensitive screening obtained by surface plasmon resonance indicated that by manipulating temperature conditions and buffer type, different ligand-analyte interactions could be established. This dynamic binding-elution profile of mcDNA and PP species, under specific conditions, indicated these peptides could possibly be employed in the development of a platform for biopharmaceuticals isolation or purification. Alongside with these studies, the development of biocompatible nanosized gene delivery systems based on amino acid modified chitosan was explored. For this purpose L-histidine and L-arginine amino acids were selected for chitosan backbone functionalization through a two-step chemical modification. In this study it was proposed that amino acid biocompatible moieties could improve the polymer physicochemical structure and its capacity to condense and deliver genetic material to cancer cells. The chemical modification of chitosan with both amino acid moieties through zero-length crosslinkers was successful and resulted in the development of a novel biofunctionalized material with pH-responsive character and positive charge. These characteristics allowed the formulation of DNA-nanocarriers through attractive electrostatic interactions with model pDNA vectors, under mild conditions. These nanoparticles achieved an improved cellular uptake and higher transgene expression efficiency in cancer cells when compared to their non-modified counterparts. As a further attempt to improve the selectivity of these delivery systems towards target cancer cells, in a subsequent study, the hybrid polymer was chemically grafted with poly(ethylene glycol)-folic acid blocks via Michael type thiol-maleimide coupling. This chemical grafting promoted a selective inclusion of folic acid cell targeting moieties into amino acid modified chitosan. The targeting specificity of the formulated DNA-loaded multifunctional carriers was confirmed in in vitro 2D co-culture models comprised by folic acid positive cancer cells and normal human fibroblasts. In addition, the results obtained in 3D multicellular spheroids indicated that the targeted particles penetrated into these in vitro models of solid tumors and accomplished significant transgene expression. A time-course, high-throughput analysis, performed after nanocarriers containing the p53 tumor suppressor DNA were administered, revealed a reduction in spheroids volume along time, thereby supporting the possible use of this technology for cell-selective gene transfer. From this standpoint, it was hypothesized that polymeric delivery systems could also be used for simultaneous co-delivery of chemotherapeutic drugs and DNA biopharmaceuticals. It was anticipated that such combinatorial approach could provide a superior anticancer effect and contribute for the development of more efficient treatments. To materialize this challenging concept, beyond-state-of-the-art triblock copolymers were chemically synthesized since biofunctional chitosan nanocarriers required complex chemical modifications to co-encapsulate mcDNA and drugs. The new synthetic nanomaterials for co-delivery were produced in an application-oriented, safe-by-design, approach that took into account the necessity to assure materials biocompatibility, biological performance and also the physicochemical properties required for simultaneous encapsulation of drug and genes in a single nanocarrier. The obtained results demonstrate that the triblock copolymers self-assembled into nanosized biocompatible micelles with core-shell structure in aqueous environment and condensed mcDNA vectors with high efficacy. In vivo administration of mcDNA-loaded micelleplexes to solid tumors also originated significant transgene expression, which shows the therapeutic potential of this delivery system. The co-delivery concept was also demonstrated with the simultaneous encapsulation of an anticancer drug (Doxorubicin), and mcDNA, in the micellar carriers. As revealed by confocal microscopy and metabolic assays, the dual-loaded micelleplexes presented significant cellular uptake and cytotoxic activity in cancer cells when compared to free drug. After demonstrating the potential associated with drug-gene co-delivery, the formulation of stimuli-sensitive co-delivery systems was investigated. The production of carriers with dynamic response to precise biological cues was expected to provide a new level of therapeutic efficiency since the release of bioactive molecules could be controlled in a spatiotemporal mode. To explore the manufacture of such “smart” nanomaterials two different approaches based on the formerly developed nanocarriers were explored. In a first study, mcDNA-loaded biofunctionalized chitosan nanocarriers were encapsulated in gas-generating poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) biodegradable microspheres, previously loaded with an antitumoral drug and sodium bicarbonate. The assembled nanoparticle-in-microsphere hybrid systems were capable of generating carbon dioxide (CO2) bubbles in acidic environment due to bicarbonate presence. In turn, this gas production originated a rapid disassemble of microspheres shell, and consequent contents release. In vitro, the dual-loaded hybrid carrier demonstrated a higher cytotoxicity in cancer cells when compared to that of free drugs or single drug-loaded microspheres. In addition to this platform, in a second study the cationic block of the triblock copolymers was modified with disulfide linkages to allow a redox-responsive release of mcDNA vectors in intracellular compartments poly(2-ethyl-2-oxazoline)-poly(L-lactic acid)-g-polyethylenimine-disulfide (PEOz-PLA-g-PEI-SS). In this study an affinity chromatography monolith disk immobilized with previously investigated L-arginine dipeptide ligands was used to isolate mcDNA supercoiled isoform. The evaluation of bioreducible micelles in 3D in vitro models and orthotopic in vivo tumors indicated that this system has improved transgene expression efficacy and promotes tumor regression when it is used for co-delivery of Doxorubicin and mcDNA. Overall, the research performed throughout this Doctoral thesis described improvements in mcDNA production process and led to the discovery of potential ligands for the isolation of its supercoiled isoform. The original results obtained during this work provide an important body of knowledge in the applicability of the mcDNA technology at a larger scale. Furthermore, the pre-clinical evaluation performed on newly developed nanomedicines demonstrated that grafting multifunctional moieties, or imprinting a stimuli-sensitive character to nanocarriers has a positive effect on their biological performance. It is important to mention that the future inclusion of one or more tumor suppressor genes in mcDNA vectors may contribute to potentiate their therapeutic effect. In this context, and as a concluding remark, the particularly promising results obtained with the administration of PEOz-PLA-g-PEI-SS dual-loaded and stimuli-sensitive micelles demonstrated that these systems enclose an outstanding potential for medical applications in a foreseeable future.A prevalência de um grande número de doenças que atualmente afetam o bem-estar da população ou que são responsáveis por elevadas taxas de mortalidade, constitui um dos maiores desafios que a sociedade enfrenta na atualidade. Por forma a restituir a qualidade de vida aos pacientes e melhorar a saúde da população em geral, têm sido realizados vários esforços no sentido de acelerar o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que possam ser aplicadas no tratamento de patologias particularmente complexas ou incuráveis, como é o caso do cancro. Atualmente, os tratamentos que são administrados a pacientes diagnosticados com neoplasias malignas apenas permitem obter uma pequena melhoria ao nível das taxas de sobrevivência e um curto incremento do tempo de vida sem ocorrer a reincidência do tumor. Por outro lado, é importante salientar, que mesmo estas pequenas melhorias acarretam efeitos secundários severos que agravam o estado de saúde dos pacientes durante o tratamento oncológico. Esta realidade reforça a necessidade urgente de explorar novas abordagens terapêuticas, que possam ser mais eficientes e menos tóxicas para o organismo. Entre as várias terapias que presentemente se encontram em desenvolvimento para tratamento do cancro, a terapia génica baseada na administração de biofármacos constituídos por ácidos nucleicos, nomeadamente ADN não viral, tem revelado um grande potencial a nível terapêutico. De facto, contrariamente aos agentes anticancerígenos utilizados em meio clínico, os biofármacos de ADN podem conter simultaneamente informação genética que bloqueie a proliferação celular desregulada, ou que induza a morte das células cancerígenas sem que os tecidos saudáveis sejam afetados. Além destas caraterísticas únicas, os grandes desenvolvimentos observados nas últimas décadas na produção de biofármacos de ADN, e o facto de estes serem aprovados pelas agências reguladoras europeias e norte americanas (Agência Europeia do Medicamento (EMA) e a Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos da América (US-FDA), respetivamente), reforçam o potencial de aplicação clínica da tecnologia do ADN não viral. Neste contexto, o ADN plasmídico (pADN) permanece como o vetor mais utilizado para terapia génica. No entanto, apesar das potencialidades do pADN, a sua utilização a nível clínico encontra-se limitada pela sua baixa eficácia e rápida degradação in vivo. Tendo em conta estes problemas, novas abordagens têm sido desenvolvidas para incrementar a utilização do ADN não viral como um biofármaco eficaz. Os vetores de ADN minicircular (mcADN) são uma das alternativas que recentemente começou a ser explorada para terapia génica. Estes vetores são entidades epissomais geradas durante o crescimento bacteriano e que contêm apenas o transgene de interesse e o promotor necessário à sua transcrição do em células eucarióticas. Ao contrário do pADN, estas entidades não contêm a sequência de ácidos nucleicos necessária para amplificação bacteriana. A remoção desta informação genética supérflua origina, por sua vez, um aumento significativo da atividade biológica do mcADN. Na sua essência, a tecnologia do mcADN é baseada na recombinação intramolecular de vetores plasmídicos especialmente desenhados para gerar mcADN e mini plasmídeos que contêm as sequências bacterianas indesejáveis. Posteriormente os vetores plasmídicos remanescentes (plasmídeos parentais e mini-plasmídeos) são parcialmente eliminados por ação de nucleases, durante o crescimento bacteriano. Este mecanismo complexo foi apenas recentemente descrito e muitos dos seus parâmetros permanecem ainda por investigar. A otimização deste bioprocesso assume assim um papel fulcral do ponto de vista da produção e aplicação terapêutica, uma vez que vários fatores podem afetar a quantidade e a pureza dos biofármacos produzidos. Para além da necessidade de explorar de forma mais aprofundada a tecnologia do mcADN, é também importante melhorar o seu modo de administração, uma vez que este parâmetro permanece como um dos principais fatores que restringe a aplicação dos biofármacos de ADN em meio clínico. O desenvolvimento de novas formulações farmacêuticas que permitam explorar e inovar a administração do material genético exógeno, pode assim ter um tremendo impacto no tratamento do cancro ou de outras doenças. Tendo em conta este contexto, este doutoramento teve como objetivo otimizar os parâmetros de biossíntese do mcADN, desenvolver e testar novos ligandos que permitam a sua purificação de acordo com as normas internacionais, e ainda produzir novos transportadores poliméricos que permitam efetuar a entrega destes vetores in vitro e in vivo. Como um ponto adicional a este estudo integrativo, foi também explorada a formulação de micro e nanoveículos com capacidade de responder a estímulos biológicos e que simultaneamente permitam a entrega de novas combinações de mcADN e fármacos anticancerígenos. Inicialmente, procedeu-se ao estudo dos parâmetros associados ao processo de produção do mcADN, nomeadamente através da avaliação e manipulação da replicação dos plasmídeos parentais (PP) numa estirpe da bactéria Escherichia coli modificada geneticamente (ZYCY10P3S2T). Durante estes estudos, investigou-se se a manipulação da temperatura de crescimento das culturas bacterianas poderia ter um impacto positivo ao nível da quantidade de mcADN produzido em fases posteriores do processo, uma vez que, um maior número de espécies parentais estaria disponível para dar origem ao mcADN. Os resultados obtidos indicaram que um aumento da temperatura de crescimento de 37 °C para 42 °C originava uma maior quantidade de vetores PP por biomassa. Neste estudo, foi também efetuada uma monitorização da conversão de PP em mcADN e mini plasmídeos durante o crescimento bacteriano. Esta monitorização permitiu estabelecer pontos-chave, durante a fase de conversão de PP para mcADN, em que a produção e a pureza das preparações do mcADN era máxima. Estes resultados constituem um importante ponto de partida para a criação de um protocolo de produção que assegure máxima produtividade, pureza, e qualidade destes biofármacos. Após a otimização dos parâmetros de produção do mcADN foi seguidamente estudada a utilização de di-péptidos de L-arginina para efetuar o isolamento e purificação do mcADN. Estes novos ligandos são particularmente interessantes para as aplicações acima descritas, pois mimetizam as interações bioespecíficas que ocorrem naturalmente entre os aminoácidos e o ADN in vivo. Como prova de conceito, amostras de PP e mcADN foram injetadas em chips microfluídicos contendo os di-péptidos de arginina imobilizados quimicamente. Durante estes ensaios, foi utilizada a técnica de ressonância de plasmões de superfície que permitiu analisar de forma mais exata as interações estabelecidas entre os analitos de ADN e os ligandos imobilizados. Os resultados obtidos, revelaram que a formação, ou a quebra das interações analito-ligando, depende da temperatura e do tipo de solução tampão que é colocada na superfície do chip, antes, e durante, a injeção das amostras de ADN. Este perfil de ligação-eluição sob condições específicas comprovou a potencial utilização destes ligandos para o isolamento ou purificação de biofármacos de mcADN. Além dos estudos anteriores, foram também desenvolvidos novos nanotransportadores para efetuar a entrega de ADN exógeno às células alvo. Numa fase inicial, foi efetuada a modificação do quitosano através de ligações química com diferentes aminoácidos, nomeadamente a L-arginina e a L-histidina, com o intuito de melhorar as caraterísticas físico-químicas do biopolímero e a sua capacidade de entregar material genético a células cancerígenas. O quitosano foi funcionalizado através da utilização de carbodiimida/sucinimida para promover a conjugação química entre o C-terminal dos aminoácidos e as aminas (-NH2) primárias da cadeia polimérica. O sucesso da funcionalização do polímero foi verificado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (2D 1H RMN) e por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), que demonstraram a existência de um novo material biologicamente ativo, isto é, com carater responsivo ao pH e com carga positiva à sua superfície. Estas caraterísticas foram utilizadas para produzir nanopartículas através de interações electroestáticas que são naturalmente estabelecidas entre os vetores plasmídicos modelo e a cadeia polimérica catiónica. Estudos in vitro em que foram usadas células tumorais demonstraram que as nanopartículas biofuncionais contendo ADN plasmídico possuíam uma maior capacidade de internalização e também uma maior eficácia de transfeção, quando comparadas com nanopartículas apenas formadas por quitosano não modificado. Com o objetivo de aumentar a seletividade destes nanotransportadores para as células alvo, num estudo subsequente, o quitosano-histidina-arginina foi modificado com cadeias de maleimida-poli(etileno glicol)-ácido fólico (MAL-PEG-FA) através da reação entre grupos tiol e o grupo maleimida do polímero MAL-PEG-FA. Esta abordagem, não só permitiu ligar eficazmente o polímero PEG, que confere uma maior estabilidade no ambiente biológico, mas também permitiu ligar quimicamente as pequenas moléculas de FA que são reconhecidas pelo recetor folato geralmente sobre-expresso na superfície das células tumorais. A seletividade destes sistemas de entrega direcionada foi avaliada in vitro em modelos de co-culturas 2D formados por células tumorais que sobre-expressam o recetor folato e por fibroblastos da pele. A internalização das nanopartículas nas células cancerígenas foi estudada por microscopia confocal e citometria de fluxo, tendo os resultados revelado que os nanotransportadores são seletivamente internalizados nas células tumorais. Neste estudo, foi ainda avaliada a internalização destes nanossistemas em aglomerados tridimensionais de células cancerígenas (esferoides 3D). Os resultados obtidos demonstraram que as nanopartículas funcionalizadas com PEG-FA tinham a capacidade de penetrar nestes modelos de tumores sólidos e de promover a expressão de um gene modelo. Para completar estes estudos, as nanopartículas foram ainda utilizadas para efetuar a entrega de ADN plasmídico contendo o gene supressor de tumores p53 a esferoides de células tumorais. Após a entrega do material genético verificou-se que ocorreu uma diminuição do tamanho dos esferoides, o que permitiu verificar a utilização desta tecnologia para transferência de genes de forma seletiva às células tumorais. Posteriormente, foi explorada a possibilidade de utilizar nanoveículos poliméricos para co-entrega de fármacos anticancerígenos e biofármacos de mcADN. Este estudo baseou-se no facto de que a entrega simultânea de múltiplas moléculas bioativas pode trazer benefícios em termos de eficiência terapêutica. Para concretizar este conceito de co-entrega, foram produzidos novos nanomateriais poliméricos, uma vez que as nanopartículas de quitosano necessitavam de modificações químicas complexas para terem capacidade de encapsular fármacos e condensar ácidos nucleicos simultaneamente. Para sintetizar os novos nanomateriais, foi utilizada a técnica de polimerização por abertura do anel do L-ácido lático para promover a formação de um copolímero de dois blocos composto pelo material hidrofílico poli(2-etil-2-oxazolina) e pelo material hidrofóbico poli(L-ácido lático) (PEOz-PLA). Após ter sido verificada a formação deste nanomaterial, o grupo hidroxilo deste copolímero foi ativado e conjugado quimicamente com polietilenimina linear (PEI) para formar um copolímero contendo três componentes (PEOz-PLA-g-PEI) e com caráter anfifílico e catiónico. Estes nanomateriais foram produzidos de uma forma orientada para a sua aplicação, tendo por base a necessidade de assegurar a biocompatibilidade, atividade biológica e também as caraterísticas físico-químicas para incorporar fármacos e genes num único nanotransportador. De forma a promover a formação de nanoveículos, os copolímeros foram dispersados em soluções aquosas e irradiados com ultrassons. Este procedimento originou a formação espontânea de nanomicelas com uma arquitetura núcleo-concha e com uma carga positiva na sua superfície. Por outro lado, como demonstrado pelos ensaios realizados por electroforese em gel de agarose, as micelas pré-formadas foram capazes de complexar, através de interações eletrostáticas, os vetores de mcADN carregados negativamente. A administração de micelas PEOz-PLA-g-PEI/mcADN em modelos in vivo de tumores da mama demonstrou que estes transportadores asseguram uma expressão eficaz do transgene incluído no mcADN. Adicionalmente, o conceito de co-entrega de fármacos anticancerígenos (Doxorubicina) e mcADN foi comprovado através da incorporação simultânea destas moléculas bioativas nas micelas. Estudos efetuados através de microscopia confocal e de ensaios metabólicos não radioativos indicaram que os nanoveículos contendo fármacos e ácidos nucleicos possuem uma grande eficácia de internalização e desencadeiam a morte celular das células tumorais devido à ação do composto anticancerígeno. Após ter sido demonstrado o potencial desta múltipla administração, foi investigada a possibilidade de produzir veículos para co-entrega que tivessem a capacidade de responder a estímulos biológicos. A produção destes transportadores responsivos a estímulos biológicos teve por base o conceito de que esta propriedade poderia melhorar o controlo da libertação das moléculas bioativas no local alvo e no tempo desejado. Para concretizar a produção destes nanomateriais “inteligentes”, foram testadas duas abordagens diferentes com os nanoveículos produzidos anteriormente: (i) nanopartículas poliméricas compostas por quitosano modificado com aminoácidos e (ii) nanomicelas poliméricas compostas por PEOz-PLA-g-PEI. Num primeiro estudo, foram produzidas pelo método de dupla emulsão agua-óleo-água (W/O/W) com difusão e evaporação do solvente, microesferas biodegradáveis compostas por poli(D,L-ácido láctico-co-glicólico)-álcool polivinílico-D-α-tocoferol-PEG sucinato. Nas microesferas foi incorporado bicarbonato de sódio (NaHCO3), o fármaco doxorubicina e também nanopartículas de quitosano-histidina-arginina/mcADN para promover a co-entrega de moléculas bioativas. A incorporação do bicarbonato de sódio conferiu às microesferas um caráter responsivo ao pH visto que este composto origina a formação de dióxido de carbono (CO2) em meio ácido, similar ao encontrado nos tumores sólidos in vivo. O gás formado originou, por sua vez, a destruição da parede das microesferas tal como se comprovou por microscopia eletrónica de varrimento. Esta destruição das micropartículas promoveu a libertação das nanopartículas de mcADN e também do agente anticancerígeno doxorubicina. Os resultados obtidos por microscopia confocal confirmaram não só a incorporação das nanopartículas dentro das microesferas, como também permitiram visualizar a internalização destes veículos nas células tumorais do colo do útero e ainda a expressão do gene contido no mcADN. Adicionalmente, os ensaios de citotoxicidade realizados em modelos in vitro de células cultivadas em 2D, revelaram que os micro-nanoveículos híbridos promovem mais morte celular quando comparados com a ação do fármaco livre ou das microesferas contendo apenas doxorubicina. Num segundo estudo, o bloco catiónico do copolímero PEOz-PLA-g-PEI foi modificado quimicamente com ligações dissulfeto (S-S) para promover a libertação do mcADN de uma forma responsiva às condições de redução-oxidação (redox) das ligações S-S no espaço intracelular. Esta propriedade permite a libertação dos ácidos nucleicos tanto no citoplasma como no núcleo e promove uma libertação mais controlada do mcADN no interior da célula. Neste estudo foi também utilizada a tecnologia dos di-péptidos de L-arginina para isolar a isoforma superenrolada do mcADN. De forma a promover o isolamento desta isoforma do mcADN por cromatografia de afinidade os di-péptidos foram imobilizados quimicamente em colunas monolíticas. O mcADN superenrolado recuperado foi depois condensado por interações eletrostáticas estabelecidas com o novo copolímero PEOz-PLA-g-PEI-SS. Esta interação originou a formação de nanomicelas bioresponsivas contendo os ácidos nucleicos minicirculares. A administração destes nanoveículos a esferoides 3D comprovou um aumento da expressão génica quando comparado com as nanomicelas não responsivas a estímulos redox. Adicionalmente, procedeu-se também à administração das nanomicelas PEOz-PLA-g-PEI-SS contendo doxorubicina e mcADN em modelos animais. Nestes ensaios verificou-se que estes sistemas promovem uma redução do volume dos tumores ao longo do tempo. Em termos globais, a investigação efetuada durante este doutoramento permitiu identificar novos parâmetros e aperfeiçoar o processo de produção de mcADN. Posteriormente, foram também testados novos ligandos peptídicos que foram utilizados no isolamento da isoforma superenrolada do mcADN. Estes resultados são importantes num contexto laboratorial e também relevantes para a futura aplicação da tecnologia do mcADN à larga escala. Além destes avanços, a avaliação pré-clínica dos nanoveículos desenvolvidos ao longo deste doutoramento, demonstrou que a utilização de diferentes polímeros bioativos, juntamente com o caráter responsivo, tem um efeito positivo ao nível da performance biológica destes sistemas de entrega. Tendo em conta que nos estudos efetuados, os minicírculos expressaram genes modelo, pode antecipar-se que a inclusão de um, ou vários, genes anticancerígenos irá potenciar o impacto terapêutico destes vetores. Assim sendo, e em forma de análise final, de entre todos os nanotransportadores desenvolvidos, as micelas de PEOz-PLA-g-PEI-SS demonstraram uma maior eficácia na expressão génica quando comparados com os outros sistemas desenvolvidos para co-entrega. Além destes resultados promissores obtidos in vitro, a ação destes sistemas foi também validada in vivo, uma vez que foi comprovada a co-entrega eficaz de mcADN e de doxorubicina aos tumores implantados em modelos animais. Estes resultados revelam assim o enorme potencial das micelas de PEOz-PLA-g-PEI-SS para futura aplicação médica tanto ao nível do tratamento do cancro, como possivelmente de outras patologias que beneficiem da co-entrega de várias moléculas bioativas.engADN minicircular - BiossínteseCancro - Terapia génicaNanotransporte - Transportadores poliméricosdoctoral thesis101319428