Duarte, Ana Paula CoelhoFerreira, Susana Margarida ParaísoCoimbra, Alexandra Teixeira2023-09-122023-09-122023-08http://hdl.handle.net/10400.6/13419For centuries, plants have been used for a wide variety of purposes, such as treating diseases, food flavouring and preservation and perfumery. The essential oils (EOs) are aromatic, oil-like volatile substances present in different plant materials that have a wide range of biological activities and can be used in different areas, such as chemical, cosmetic, food, perfumery, and pharmaceutical industries and have been used as therapeutic agents since ancient times. Thymus zygis is a widespread plant, mainly used as a culinary flavouring agent, which EO has demonstrated bioactive properties, such as antioxidant and antimicrobial, and that may even enhance the effect of certain antimicrobial agents. Furthermore, the potential application as a food preservative has been described on different matrixes mainly due to its antimicrobial activity against pathogenic and spoilage microorganisms in food. Considering the different applications of EOs, this work aimed to study the composition, antioxidant, and antimicrobial properties and also the cytotoxicity of the EOs of Foeniculum vulgare, Helichrysum stoechas, Mentha pulegium, Pinus pinaster, Ruta graveolens, and Thymus mastichina. The chemical composition, and the bioactive properties of the T. zygis EO were also evaluated with a focus on antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes, and application of the EO in food. The F. vulgare, H. stoechas, M. pulegium, P. pinaster, R. graveolens, T. mastichina and T. zygis EOs showed antioxidant activity acting through inhibition of lipid peroxidation, while only the H. stoechas, M. pulegium and T. zygis EOs scavenged the free radicals of DPPH. M. pulegium and T. zygis EOs showed the strongest antimicrobial activity and only volatiles compounds from these EOs demonstrated inhibitory activity. Regarding the EO cytotoxicity on a fibroblasts cell line, it was observed that the effect was directly proportional to the EOs concentration, in which the highest cytotoxic effect was obtained with the R. graveolens EO. Considering the antimicrobial potential of the EO from T. zygis and since it showed the greater activity among the tested EOs, it was decided to proceed with further evaluation of this EO, thus deepening its bioactive activities, mainly the antibacterial activity against S. aureus and L. monocytogenes. Taking into account that S. aureus is a Gram-positive bacterium that causes a wide variety of clinical infections, from less severe to serious and life-threatening infections and because these are aggravated by antibiotic resistance, the antibacterial activity of T. zygis EO against strains of S. aureus was evaluated. The T. zygis EO demonstrated antimicrobial activity against S. aureus strains with bactericidal effect. The EO of T. zygis also revealed a synergistic or additive effect in combination with the antibiotic’s ampicillin, ciprofloxacin, or vancomycin against S. aureus strains and, in some cases, changed the antibiotic-resistance phenotype from resistant to susceptible. The T. zygis EO inhibit the formation of biofilms by S. aureus and partially eliminate the preformed biofilms even at subinhibitory concentrations. The EO reduced the haemolytic activity of S. aureus SA 03/10 (the only strain tested that causes haemolysis) as well the quorum-sensing in Chromobacterium violaceum biosensor. Therefore, these results demonstrate the good bioactive properties of the T. zygis EO, mainly the antimicrobial activity against S. aureus, revealing its potential to be used as an antibacterial agent and/or as an enhancer of the effect of antibiotics. Since L. monocytogenes is a foodborne Gram-positive bacterium with a high mortality rate and has the ability to survive and replicate in adverse conditions, allowing the wide distribution of this bacterium in different environments and matrices, such as water, soil, and food products, the antimicrobial activity of T. zygis EO against strains of L. monocytogenes was evaluated. The T. zygis EO presented good antibacterial activity against L. monocytogenes with MIC value of 0.05% while showing a bactericidal effect. The EO significantly reduced the biofilm formation with inhibition percentages from 16.85 to 89.86% and also the motility, while not inducing cross-resistance to antibiotics. The concentration of 2× MIC of T. zygis EO reduced the L. monocytogenes counts (initial inoculum of ~106 CFU/mL) in the chicken juice (1.53 log CFU/mL) and the lettuce model (to below the detection limit) after two days of storage. Regarding the sanitizing of fresh vegetables, the use of 0.2% (v/v) of EO for 5 min of immersion, reduce L. monocytogenes and natural microbiota counts for values below the detection limit of the method for iceberg lettuce. For the spinach leaves, L. monocytogenes and the natural microbiota counts were reduced to 4.35 log CFU/mL and in a range of 4.47 to 5.94 log CFU/mL, respectively, when compared with the washing with water. Thus, the T. zygis EO has demonstrated promising antibacterial activity against L. monocytogenes and these results point to the potential use of the T. zygis EO as a natural food preservative or sanitiser for controlling L. monocytogenes and the natural microbiota in food products. Overall, the present study revealed significant bioactive properties of different EOs, highlighting T. zygis EO to be considered in further studies for potential use in food preservation, due to their antioxidant and antimicrobial properties as well as in the control and reduction of the pathogenicity of the L. monocytogenes and S. aureus.Durante séculos, as plantas têm sido utilizadas numa ampla variedade de aplicações, tais como o tratamento de doenças, aromatização e conservação de alimentos e perfumaria. Os óleos essenciais são substâncias voláteis aromáticas, presentes em diferentes partes das plantas, como frutas, sementes, polpa, casca ou raiz e que têm sido usados como agentes terapêuticos desde a antiguidade. De facto, estes possuem uma ampla gama de atividades biológicas, podendo ser aplicados em diferentes áreas, como química, cosmética, indústria alimentar, perfumaria e farmacêutica. O Thymus zygis é uma planta amplamente distribuída, utilizada principalmente como aromatizante culinário e o seu óleo essencial tem demonstrado propriedades bioativas, como atividade antioxidante, antibacteriana, inseticida e antiparasitária. Além disso, a potencial aplicação como conservante de alimentos tem sido descrita em diferentes matrizes alimentares, principalmente devido à sua atividade antimicrobiana contra microrganismos patogénicos e deteriorantes de alimentos. O aumento da resistência dos microrganismos aos antibióticos e o surgimento de novas doenças, exigem o desenvolvimento urgente de novos agentes antimicrobianos mais fortes e eficazes. Assim, as plantas medicinais são promissoras, pois oferecem fontes únicas e renováveis de novos compostos com propriedades bioativas. Considerando as diferentes aplicações dos óleos essenciais, este trabalho teve como objetivos estudar a composição, propriedades antioxidantes, antimicrobianas e também a citotoxicidade dos óleos essenciais de Foeniculum vulgare, Helichrysum stoechas, Mentha pulegium, Pinus pinaster, Ruta graveolens e Thymus mastichina e avaliar a composição química e as propriedades bioativas do óleo essencial de T. zygis com foco na atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus bem como o seu efeito anti-Listeria monocytogenes e aplicação em alimentos como conservante. Através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) verificou-se que os óleos essenciais possuem composição diferente, identificando-se diversos compostos no óleo essencial de F. vulgare (12 compostos), H. stoechas (27), M. pulegium (8), P. pinaster (24), R. graveolens (8), T. mastichina (16) e por fim no EO de T. zygis 18 compostos com o anetol, acetato de neril, pulegona, α-pineno, 2-undecanona, 1,8-cineol e timol como compostos maioritários, respetivamente. Apenas os óleos essenciais de H. stoechas, M. pulegium e T. zygis sequestraram os radicais livres de DPPH exibindo uma atividade antioxidante muito forte, enquanto todos os óleos essenciais apresentaram atividade antioxidante atuando por meio da inibição da peroxidação lipídica de acordo com o ensaio do β-caroteno. Assim, verificou-se que os óleos essenciais de H. stoechas, M. pulegium e T. zygis possuem atividade antioxidante através de pelo menos dois mecanismos de ação distintos, a sequestração de radicais livres e inibição da peroxidação lipídica. Os óleos essenciais de M. pulegium e T. zygis exibiram atividade antimicrobiana mais relevante com concentração mínima inibitória (MIC, do inglês minimum inhibitory concentration) entre os valores de 0,06 e 4 μL/mL, exceto para Pseudomonas aeruginosa, que foi a espécie mais resistente. As espécies de Candida foram as mais suscetíveis a estes óleos essenciais (halos de inibição entre 30,94 ± 5,34 e 64,35 ± 4,44 mm) e apenas os compostos voláteis destes dois óleos essenciais, libertados do disco durante a incubação, demonstraram atividade inibitória (halos de inibição entre 19,28 ± 3,45 e 65,18 ± 8.78 mm). Por outro lado, os óleos essenciais de H. stoechas e R. graveolens revelaram a atividade antimicrobiana mais fraca (halos de inibição entre 6,00 ± 0,00 e 11,82 ± 1,07 mm e MIC entre 16 e >256 μL/mL). Em relação à citotoxicidade dos compostos, esta foi avaliada considerando o seu efeito sobre uma linha celular de fibroblastos (NHDF), sendo que o efeito foi diretamente proporcional à concentração de óleos essenciais, obtendo-se maior atividade citotóxica com o óleo essencial de R. graveolens. Pelo contrário, com o óleo essencial de T. zygis com concentrações entre 0,0030 e 0,0125%, obteve-se viabilidade superior a 70% e tendo em conta a ISO 10993:5-2009, pode-se considerar que estas concentrações não são citotóxicas. Tendo em atenção o potencial antimicrobiano do óleo essencial de T. zygis e uma vez que mostrou maior atividade que os restantes óleos essenciais, decidiu-se avançar com estudos com este óleo essencial, aprofundando assim as suas atividades bioativas, principalmente a atividade antibacteriana contra S. aureus e L. monocytogenes. Considerando que S. aureus é uma bactéria Gram-positiva que causa vários tipos de infeções clínicas, e que em alguns casos pode estar associada a elevada morbilidade e mortalidade, as quais podem ser agravadas pela resistência a antibióticos, a atividade antibacteriana do óleo essencial de T. zygis foi avaliada contra estirpes desta espécie. O óleo essencial revelou atividade antimicrobiana contra estirpes de S. aureus com MIC de 0,05 e 0,1% (v/v) apresentando efeito bactericida. Para além disso, os compostos voláteis do óleo essencial de T. zygis também inibiram o crescimento destas estirpes. Relativamente ao efeito combinado com antibióticos, o óleo essencial de T. zygis demonstrou um efeito sinérgico em combinação com os antibióticos ampicilina e ciprofloxacina contra a estirpe S. aureus MRSA 12/08 e efeito aditivo com a vancomicina. Em relação às estirpes S. aureus ATCC 25923 e SA 03/10, a combinação do óleo essencial de T. zygis com os três antibióticos revelou efeito aditivo. Em alguns casos, a junção do óleo essencial de T. zygis alterou o fenótipo de resistente para suscetível ao antibiótico, de acordo com os valores de corte do Clinical and Laboratory Standards Institute, como se pode verificar para a estirpe SA 03/10 aos três antibióticos testados e para a estirpe MRSA 12/08 à ampicilina e ciprofloxacina em que os valores de MIC reduziram consideravelmente restaurando a sensibilidade a estes. Adicionalmente, o óleo essencial de T. zygis também inibiu a formação de biofilmes formados pelas estirpes de S. aureus e eliminou parcialmente os biofilmes preformados mesmo em concentrações subinibitórias. A pré-exposição de S. aureus a concentrações subinibitórias do óleo essencial de T. zygis reduziu significativamente a atividade hemolítica de S. aureus SA 03/10 (única estirpe em estudo que provocou hemólise de eritrócitos) em comparação com os respetivos controlos, de forma dose-dependente. A comunicação entre células permite o controlo da regulação e libertação de fatores de virulência por parte das bactérias e utilizando Chromobacterium violaceum como um biossensor para avaliar o potencial do óleo essencial como inibidor deste processo, os resultados mostraram que concentrações subinibitórias do óleo essencial de T. zygis inibiram significativamente a produção do pigmento violaceína sem afetar o crescimento deste biossensor. Assim, verificou-se que este óleo essencial também reduz esse processo de regulação de virulência. Resumindo, as concentrações testadas de óleo essencial de T. zygis reduzem significativamente o crescimento de S. aureus, tanto de células planctónicas como de biofilmes, potenciam o efeito de antibióticos e inibem a capacidade hemolítica e a comunicação entre células. Portanto, esses resultados demonstram promissoras propriedades bioativas do óleo essencial de T. zygis, revelando o seu potencial para ser utilizado como agente antibacteriano e/ou potenciador do efeito de antibióticos. Tendo em conta que L. monocytogenes é um dos agentes bacterianos causadores de doenças transmitidas por alimentos com mais elevada taxa de mortalidade e possui a capacidade de sobreviver e de se replicar em condições adversas vulgarmente associadas ao sector alimentar permitindo a sua ampla distribuição em diferentes ambientes e matrizes alimentares, foi avaliada a atividade antimicrobiana do óleo essencial de T. zygis contra estirpes desta bactéria. O óleo essencial de T. zygis apresentou também atividade antibacteriana contra L. monocytogenes com halos de inibição entre 41,55 ± 2,63 e 55,04 ± 3,64 mm, tal como os seus compostos voláteis (halos de inibição entre 36,13 ± 3,41 e 50,43 ± 2,59 mm), com um MIC de 0,05%, apresentando também efeito bactericida. Concentrações subinibitórias do óleo essencial reduziram significativamente a motilidade das três estirpes em estudo, reduzindo também a formação de biofilme com percentagens de inibição entre 16,85 e 89,86%, mesmo com concentrações subinibitórias. Uma pré-exposição de L. monocytogenes ao óleo essencial de T. zygis, apenas aumentou a robustez de L. monocytogenes quando sujeita a stress osmótico, não afetando a sua tolerância a outros fatores de stress, tais como a dessecação, pH ácido e elevadas temperaturas. Para além disso, a pré-exposição a óleo essencial de T. zygis não induziu resistência cruzada a antibióticos de diferentes classes, como ampicilina, cefotaxima, eritromicina, gentamicina, tetraciclina e vancomicina. Como a capacidade de invasão desta bactéria permite a passagem através das células epiteliais do intestino, provocando infeções generalizadas no hospedeiro, o óleo essencial de T. zygis foi testado em relação à capacidade de invasão em células de adenocarcinoma colorretal humano (Caco-2). A incubação com concentrações subinibitórias do óleo essencial de T. zygis não afetou o poder de invasão de L. monocytogenes, sendo assim considerado um fator neutro. Uma vez que o uso de compostos antimicrobianos sintéticos como conservantes de alimentos tem despertado a preocupação dos consumidores e tendo em atenção a atividade antimicrobiana obtida para o óleo essencial de T. zygis, avaliou-se o uso deste óleo como um conservante e desinfetante de alimentos. Verificou-se que as duas concentrações mais elevadas do óleo essencial de T. zygis (2× e 1× MIC) reduziram significativamente as contagens de L. monocytogenes (inóculo inicial de ~106 UFC/mL) num modelo de suco de frango (1,53 log UFC/mL) e no modelo de alface Iceberg (abaixo do limite de deteção), após dois dias de armazenamento em refrigeração. Em relação às amostras de leite (leite magro e leite gordo), a diferença no conteúdo lipídico influenciou a atividade antibacteriana do óleo essencial de T. zygis, sendo que apenas se obteve uma redução significativa das contagens bacterianas com a concentração mais elevada e no leite magro. Para concentrações subinibitórias do óleo essencial de T. zygis, apenas a concentração 0,5× MIC mostrou uma redução significativa e apenas no modelo de alface, a partir do quarto dia de armazenamento. Em relação à desinfeção de vegetais frescos, o uso de 0,2% (v/v) de óleo essencial por 5 min de imersão, reduz a contagem de L. monocytogenes e da microbiota natural para valores abaixo do limite de deteção do método na lavagem das folhas de alface. Nas folhas de espinafre, as contagens de L. monocytogenes e da microbiota natural foram reduzidas para 4,35 log UFC/mL e no intervalo de 4,47 a 5,94 log UFC/mL, respetivamente, quando comparadas com a lavagem apenas com água. Assim, o óleo essencial de T. zygis demonstrou atividade antibacteriana promissora contra L. monocytogenes e estes resultados apontam para o potencial uso do óleo essencial de T. zygis como conservante ou desinfetante natural de alimentos para o controlo de L. monocytogenes e da microbiota natural em produtos alimentares. No geral, o presente estudo revelou propriedades bioativas significativas de diferentes óleos essenciais, destacando o óleo essencial de T. zygis, a ser considerado em estudos futuros, devido às suas propriedades antioxidantes e antimicrobianas, bem como no controle e redução da patogenicidade de S. aureus e L. monocytogenes.engÓleos essenciaisCromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa -GC-MSAtividade antioxidanteAtividade antimicrobianaCitotoxicidadeThymus zygisStaphylococcus aureusListeria monocytogenesAtenuação da virulênciaInteração com antibióticosDesinfetanteVegetaisdoctoral thesis101714041