Socorro, Sílvia Cristina da Cruz MarquesCavaco, José Eduardo BritesVan Pelt, Anna Maria MargarethaCorreia, Sara Carina de Lima2016-02-032016-02-032014http://hdl.handle.net/10400.6/3987Spermatogenesis is the intricate and coordinated process by which thousands of spermatozoa are produced daily within the male gonad. In addition, mammalian testis also serves as an endocrine organ, producing the sex steroid hormones needed for normal spermatogenesis and development of male phenotype. Over the years, estrogens have emerged as important regulators of male reproductive function, but their role in spermatogenesis has remained a matter of controversy. There are reports indicating that estrogens are survival factors for germ cells, while other strong evidences associated their actions with testicular apoptosis and diminution of germ cell number. Furthermore, the molecular targets underpinning the survival or apoptotic effects of estrogens in mammalian testis remain to be fully elucidated. Regucalcin (RGN) is a calcium (Ca2+)‐binding protein playing an important role in the maintenance of intracellular Ca2+ homeostasis, for which a role in spermatogenesis has been suggested. RGN was identified in male reproductive tract tissues, being described as an estrogen‐target gene in rat and human prostate cells, and as an androgen‐target gene in the testis. However, the effect of estrogens controlling the expression levels of RGN in the testis is entirely unknown. Noteworthy, it has been indicated the role of RGN in the control of cell survival and apoptosis, and its antioxidant properties also have been reported. Although a tight control of apoptosis and oxidative stress are of the paramount importance for proper testis function, the role of RGN in testicular physiology has not deserved attention yet. Sperm undergo maturation acquiring progressive motility and the capacity to fertilize oocyte only during passage through the epididymis. Although a gradient of Ca2+ along the epididymis has been described, its effects on epididymal function remain poorly explored. The main objective of this thesis is to disclose the relationship between estrogens and apoptosis of germ cells, including the regulatory effects of these sex steroid hormones on the testicular expression of RGN. Secondly, the role of RGN in regulating apoptosis and oxidative stress in the testis, as well as, in sperm maturation in epididymis will be explored. A 100 nM dose of 17β‐estradiol (E2), mimicking the elevated concentrations of estrogens found in the testis of infertile patients, induced apoptosis of germ cells and decreased cell proliferation, which was accompanied by disrupted expression of the SCF/c‐kit system. E2‐ stimulation also increased RGN expression, suggesting that the augmented expression of this protein may be a mechanism to counteract E2‐induced apoptosis. Concerning the function of RGN in modulation of apoptosis in the testis, it was shown that RGN plays a pivotal role rescuing cells from apoptosis induced by noxious stimuli. Moreover, RGN overexpression led to increased protection against oxidative stress in the testis, which further confirmed the cytoprotective role of RGN. The results presented herein also demonstrated the importance of maintaining Ca2+ levels in the epididymal lumen and supported a role for RGN in sperm maturation. In conclusion, the present thesis demonstrated that elevated concentrations of estrogens may unbalance the expression of SCF/c‐kit system leading to depletion of germ cells due to augmented apoptosis and decreased proliferation, which has contributed to understand the molecular basis of hyperestrogenism related male infertility. These findings also provided a rationale to explain the successful use of aromatase inhibitors to treat male infertility, and suggested that manipulation of c‐kit and RGN levels may be a possible mechanism to preserve germ cell integrity and fertility. Thus, the action of estrogens and RGN on testis physiology and sperm function has emerged as “a matter of life and death”.A espermatogénese é um processo complexo e rigorosamente coordenado, através do qual milhares de espermatozóides são produzidos diariamente nas gónadas masculinas. Para além de realizarem esta função, os testículos dos mamíferos são um órgão endócrino, e produzem as hormonas esteróides sexuais necessárias para a estimulação do processo espermatogénico e para o normal desenvolvimento do fenótipo masculino. Nos últimos anos, os estrogénios têm sido identificados como importantes reguladores da função reproductiva masculina, no entanto, a sua função na espermatogénese não tem encontrado unanimidade entre os investigadores. Alguns estudos sugerem que os estrogénios actuam como factores de sobrevivência para as células germinativas, enquanto outros, associam a acção destas hormonas à apoptose testicular e à diminuição do número de células germinativas. Para além disso, os alvos moleculares subjacentes aos efeitos dos estrogénios no testículo dos mamíferos, levando à sobrevivência ou à morte celular, permanecem por esclarecer. A regucalcina (RGN) é uma proteína de ligação ao cálcio (Ca2+) que tem um papel importante na homeostase da concentração intracelular deste ião, e para a qual foi sugerida uma função na espermatogénese. A RGN foi identificada em diversos tecidos do tracto reproductivo masculino, sendo descrita a sua regulação pelos androgénios no testículo, bem como, a sua regulação pelos estrogénios em células de próstata de rato e humana. No entanto, são totalmente desconhecidos os efeitos dos estrogénios nos níveis de expressão da RGN no testículo. É de salientar ainda a função que tem vindo a ser atribuída à RGN ao nível do controlo da sobrevivência celular e apoptose, assim como, as suas propriedades antioxidantes. Apesar de se reconhecer que o controlo rígido da apoptose e do stress oxidativo são de importância fulcral para a função testicular, a função da RGN no testículo permanece desconhecida. É durante a passagem pelo epidídimo que os espermatozóides sofrem um processo de maturação que lhes permite adquirir motilidade progressiva e a capacidade de fertilizar o oócito. Apesar de ter sido descrita a existência de um gradiente de concentração de Ca2+ ao longo do epidídimo, os efeitos deste ião no funcionamento do epidídimo encontram-se insuficientemente explorados. A presente tese tem como objectivo principal elucidar a relação existente entre os efeitos estrogénicos e a apoptose das células germinativas, incluindo igualmente os efeitos reguladores destas hormonas esteróides na expressão testicular da RGN. Em segundo lugar, será explorado o papel da RGN na regulação da apoptose e do stress oxidativo no testículo, assim como, na maturação dos espermatozóides no epidídimo. Uma dose de 100 nM de 17βestradiol (E2), mimetizando as concentrações de estrogénios encontradas no testículo de pacientes inférteis, culminou na apoptose das células germinativas e na diminuição da proliferação, o que aconteceu simultaneamente com alterações na expressão do sistema SCF/c-kit. O tratamento com E2 foi ainda acompanhado por um aumento da expressão da RGN, o que sugere que os níveis desta proteína podem estar aumentados como um mecanismo de prevenção da apoptose induzida pelo E2. Relativamente ao papel da RGN na modulação da apoptose testicular, observou-se que esta tem um papel importante na prevenção da morte celular induzida por estímulos nocivos. Mais ainda, verificou-se que a sobreexpressão da RGN conduz a um aumento da protecção contra o stress oxidativo no testículo, o que confirma o papel citoprotector desta proteína. Os resultados obtidos demonstraram também a relevância da manutenção dos níveis de Ca2+ no lúmen do epidídimo e suportam o papel da RGN na maturação dos espermatozóides. Em suma, a presente tese demonstrou que níveis elevados de estrogénios podem destabilizar a expressão do sistema SCF/c-kit, o que leva a uma deplecção das células germinativas devido ao aumento da apoptose e diminuição da proliferação celular. O trabalho aqui desenvolvido contribuiu para o conhecimento da base molecular de casos de infertilidade masculina associados a hiperestrogenismo. Estes resultados forneceram ainda uma base racional para explicar o sucesso do uso de inibidores da aromatase no tratamento da infertilidade masculina, sugerindo também que a manipulação dos níveis de c-kit e da RGN poderá funcionar como um possível mecanismo de preservação da integridade das células germinativas e, consequentemente, da fertilidade. Assim sendo, a acção dos estrogénios e da RGN na fisiologia testicular e na função dos espermatozóides estabelece-se como “uma questão de vida ou de morte”.engSistema reprodutor masculinoEspermatogéneseInfertilidade masculinaRegucalcinadoctoral thesis101378327