Sousa, Ângela Maria Almeida dePassarinha, Luís António PaulinoGomes, Diana Vanessa Duarte2026-02-252026-02-252026-02-09http://hdl.handle.net/10400.6/19907Cervical cancer (CC) remains a significant global health burden, particularly in low- and middle-income countries, where it is a leading cause of cancer-related mortality among women. Annually, more than 600,000 new cervical cancer cases are diagnosed worldwide, with a 53% mortality rate. The development of CC is strongly associated with a persistent infection with high-risk human papillomavirus (HR-HPV), particularly HPV16 and HPV18, which are responsible for 70% of cases. This persistent HPV infection leads to uncontrolled proliferation of infected cells via downregulation of epithelial differentiation, disruption of epidermal development, and evasion of innate immune responses. The oncogenic potential of HR-HPV types is primarily attributed to the expression of E6 and E7 oncoproteins, which are integral to cancer phenotype maintenance in HPV-infected cells. Despite the implementation of preventive strategies, such as prophylactic vaccination and screening, which have contributed to a reduction in disease incidence, there remains an urgent need for targeted therapeutic interventions aimed at addressing persistent HPV infection and advanced cervical lesions. The HR-HPV E6 protein is composed of 158 amino acids and 2 zinc-binding motifs, and its most important function is escaping cell death by the induction of p53 degradation. In fact, E6 interacts with the LxxLL motif of the E6-associated protein (E6AP), an E3 ubiquitin ligase, inducing p53 degradation through the proteasome pathway and, consequently, blocking p53-dependent apoptosis. The HR-HPV E7 protein has around 98 amino acids, with an N-terminal region intrinsically disordered, whereas the C-terminal features a well-structured zinc-binding site. One of the most important protein regulation mechanisms by the E7 protein is through the retinoblastoma (pRb)/E2F system. The E7 protein binds to the pRb through the motif LxCxE, displacing E2F complexes, allowing its release and, as a result, the transcription of S-phase genes. This ensures that the infected cells remain in an S-phase-competent state, leading to hyperproliferation. Considering their crucial role in driving cellular transformation and cancer maintenance, both proteins are primary targets for developing targeted HPV therapies. However, the rational design and optimization of therapeutic strategies may depend on the ability to obtain both proteins. Unfortunatelyss, isolating E6 and E7 proteins from human cells is not feasible, so recombinant technology is a great alternative. Nonetheless, challenges persist related to the low solubility and tendency of these proteins to aggregate. Overcoming these issues is essential for enabling structural studies, biophysical characterization, and high-throughput screening of potential inhibitors. Thus, this thesis proposes the implementation of a biotechnology platform, starting with the biosynthesis towards the purification of the HPV16 E6 and E7 proteins, to ultimately discover inhibitory drugs that will be able to block the oncogenic effects triggered by both targets through biophysical and in vitro approaches. Firstly, we established a biotechnological platform for the recombinant expression and purification of HPV16 E6 in Escherichia coli BL21, employing a dual-tagged construct to enhance yield and address solubility issues. A two-step chromatographic process: affinity chromatography, followed by immobilized-metal affinity or size exclusion chromatography, obtained highly pure protein fractions (~98%). Circular dichroism confirmed that the secondary structure of His6-MBP-E6 protein is preserved in both purification strategies. Additionally, thermal shift assay (TSA) suggested potential additives for protein stabilization, such as maltose, glycerol, and detergents that can be incorporated in further characterization studies. In parallel to obtain the E6 protein, we focused on identifying natural compounds that may disrupt the E6/E6AP interaction using virtual screening. Three candidates selected from in silico studies with favorable predicted binding affinities were evaluated in HPV-negative and HPV-positive cell lines. Taxifolin and lucidin protected p53 from E6-mediated degradation and reactivated its transcriptional activity, leading to apoptosis induction. Nevertheless, neither compound affected cell cycle progression; thus, we extended the search for E6 inhibitors targeting directly the p53 binding site by exploring four distinct families of small molecules (barbiturates, dihydropyrimidinones/thiones, acetanilides and steroid derivatives). The screening was achieved through a combination of computational strategies and biophysical assays using the recombinant E6 protein previously produced. Fluorescence-based studies suggested that 4 compounds displayed a moderate affinity for the E6 protein. These candidates (CMP44, CMP50, CMP10c and CMP11c) were further characterized in HPV-positive and HPV-negative cell lines. The results demonstrated that CMP50 and CMP11c effectively rescued p53 from E6 degradation, reducing the proliferation and migration of HPV-positive cancer cells. Additionally, both compounds reactivated p53-dependent transcriptional factors, activating an apoptotic pathway and inducing cell cycle arrest, which suggests their therapeutic potential against HPV. Finally, considering the aim is also to study the E7 protein and potential inhibitors, we explored and characterized the dual-tagged recombinant HPV16 E7 protein. Following a similar workflow to what we had built for the E6 protein, we explored several chromatographic approaches, including affinity, anion-exchange, mixed-mode, and sizeexclusion chromatography, to obtain the His6-MBP-E7 protein. A thorough analysis of buffer compositions and additives indicated that a pH between 6.0 and 7.0, as well as sugars and detergents, maximized E7 solubility and minimized sample heterogeneity. In this process, we obtained the target protein with high yield, a purity of around 98% as confirmed by LC-MS/MS analysis. Additionally, the inclusion of detergents in the final formulations was studied, where the inclusion of DM (η-Decyl-β-D-Maltopyranoside) or η-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) led to a monodisperse sample. The optimized protocol is suitable for downstream structural and functional characterization, as well as for future inhibitor screening studies. Collectively, the work presented in this thesis establishes a reproducible platform for the production and study of the HPV16 E6 and E7 oncoproteins, which can be used for expressing proteins from other HPV types. Additionally, by integrating computational, biophysical, and cellular approaches, this research identified specific anti-HPV drugs, which can be the starting point for structural studies aiming at obtaining structures of the protein-inhibitor complexes.O cancro do colo do útero (CC) é a quarta maior causa de morte em mulheres a nível mundial, sendo a primeira em países pouco desenvolvidos. A nível global, o CC é responsável por mais de 600 mil novos casos e cerca de 340 mil mortes por ano. Em Portugal, estima-se que surjam anualmente cerca de 950 casos, com uma mortalidade de aproximadamente 300 mulheres/ano. Esta patologia é maioritariamente atribuída a infeções persistentes pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV), um vírus DNA de dupla cadeia, transmitido sexualmente, que afeta homens e mulheres em algum momento da vida. Existem mais de 200 genótipos deste vírus que podem ser divididos em baixo-risco e alto-risco, consoante o seu potencial oncogénico. Os HPVs de baixo risco causam lesões benignas, como verrugas genitais, enquanto os HPVs de alto risco, estão implicados no desenvolvimento e progressão de lesões pré-cancerosas para carcinoma invasivo. As lesões pré-cancerosas denominadas lesões pavimentosas intraepiteliais de baixo grau (LSIL), na maioria dos casos, desaparecem por ação do sistema imunitário, com o tempo. No entanto, por vezes podem evoluir para uma lesão de alto grau (HSIL) aumentando o risco de progredir para cancro do colo do útero. A prevenção primária e secundária do cancro do colo do útero baseia-se na vacinação profilática contra os genótipos de alto risco e no rastreio citológico e ao nível molecular (DNA e RNA). O tratamento de lesões inclui técnicas ablativas ou excisionais, e os casos avançados requerem radioterapia e/ou quimioterapia. Apesar da implementação bem-sucedida de vacinas profiláticas e de programas de rastreio, a taxa de mortalidade feminina devido ao cancro do colo do útero ainda é elevada, particularmente nos países menos desenvolvidos onde os meios financeiros para estabelecer estes programas são escassos. Adicionalmente, as vacinas profiláticas não têm impacto em infeções já estabelecidas e não conseguem acompanhar a demanda global. Além disso, as terapias atualmente disponíveis para o tratamento do cancro do colo do útero são frequentemente agressivas e não específicas, associando-se a efeitos secundários significativos e risco de recorrência, reforçando a necessidade de desenvolver estratégias terapêuticas dirigidas e eficazes. As oncoproteínas E6 e E7 dos HPVs de alto risco desempenham papéis centrais na transformação maligna das células. Estas proteínas levam à interrupção da função normal das proteínas supressoras de tumor presentes nas células hospedeiras, ativando o ciclo celular e inibindo a apoptose, o que resulta numa proliferação descontrolada das células infetadas. Além disso, estas oncoproteínas acionam vários mecanismos que acabam por promover a carcinogénese, desde o evitar a morte celular, desregulação do ciclo celular, instabilidade genómica até à modulação do sistema imunitário. Em particular, a proteína E6 dos HPVs de alto risco interage com a proteína associada a E6 (E6AP), uma ubiquitina ligase E3, sofrendo uma alteração conformacional que permite a ligação da proteína supressora de tumor p53. Estas biointerações resultam na degradação da p53, inibindo a apoptose e favorecendo a acumulação de mutações. Por outro lado, a proteína E7 interfere com a função de outro supressor de tumor, a proteína do retinoblastoma (pRb), através do motivo LxCxE, libertando os fatores de transcrição E2F e consequentemente, a transcrição dos genes da fase S. Isto leva a que células infetadas proliferem de forma descontrolada. A expressão contínua das oncoproteínas E6 e E7 dos HPVs de alto risco é essencial para a manutenção do fenótipo tumoral, o que torna estas proteínas alvos atrativos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Nos últimos anos, têm sido exploradas várias abordagens terapêuticas, desde vacinas terapêuticas, terapia génica e inibidores. No entanto, ainda não existe uma terapia específica aprovada para o cancro do colo do útero. Assim, a obtenção das proteínas E6 e E7 é um passo crítico para possibilitar a caracterização biofísica, estrutural e funcional, para o screening de inibidores da sua atividade oncogénica ou desenvolvimento de anticorpos. Infelizmente, a obtenção das proteínas E6 e E7 a partir de células humanas é inviável devido à baixa quantidade recuperada, tornando a tecnologia recombinante uma ótima alternativa. Desta forma, esta tese propõe a implementação de uma plataforma biotecnológica desde a produção até à purificação das proteínas E6 e E7, bem como a identificação de inibidores específicos através de estudos de biointeração para que, no futuro, seja possível a caracterização estrutural destes complexos. Neste contexto, começamos por desenvolver um bioprocesso para a expressão e purificação da proteína E6 do HPV16. Dada a baixa solubilidade e tendência para agregação desta proteína, a mesma foi expressa como uma proteína de fusão com His₆-MBP em Escherichia coli BL21 (His₆-MBP-E6). De seguida, desenvolvemos uma estratégia de purificação baseada em 2 passos. A cromatografia de afinidade permitiu isolar a His₆-MBP-E6 das restantes proteínas heterólogas num único passo, na fase de captura, pela inclusão de maltose no tampão de eluição. Uma das estratégias mais eficazes de polimento para esta proteína com um grau de pureza de cerca de 98% foi a cromatografia de afinidade por metais imobilizados tirando partido do tag de histidinas. A fração correspondente à proteína de interesse demonstrou ser termicamente estável com uma temperatura de melting de 47-49 °C e a estrutura secundária foi confirmada por dicroísmo circular. Adicionalmente, identificamos aditivos como glicerol, açúcares e detergentes que aumentaram a estabilidade térmica da proteína His₆-MBP-E6. Estes aditivos poderão ser incluídos na formulação final de forma a prosseguir para estudos de biointeração e caracterização estrutural. Em paralelo à obtenção recombinante da proteína E6, foi relevante proceder à identificação de compostos naturais com potencial de inibir a interação E6/E6AP. Assim, um screening através de docking molecular e simulações moleculares dinâmicas permitiu a seleção de 3 compostos com afinidades previstas semelhantes ao composto controlo. A taxifolina e a lucidina demonstraram um efeito específico para células que expressam a proteína E6 (HPV-positivas). Além disso, ambos os compostos demonstraram a capacidade de restaurar os níveis da proteína p53 e induzir morte celular programada pelo aumento da proteína BAX e ativação das caspases 3/7. Estes resultados demonstram a importância dos estudos computacionais na seleção de potenciais fármacos para o HPV. No entanto, nem a taxifolina, nem a lucidina mostraram afetar a ciclo celular das células infetadas por HPV de alto-risco, pelo que optamos por expandir o leque de pequenas moléculas em estudo e no seu potencial de inibir diretamente a interação E6/p53. Para isso, explorámos diferentes famílias de compostos semissintéticos e sintéticos (barbituratos, dihidropirimidinonas/tionas, acetanilidas e derivados de esteroides) numa abordagem inicial que combinou métodos in silico com ensaios biofísicos. Em particular, os compostos CMP44, CMP50 (acetanilidas) e CMP10c e CMP11c (derivados de esteroides) apresentaram uma afinidade moderada para a proteína E6, pelo que foram consequentemente aplicados em ensaios in vitro. Estas 4 pequenas moléculas reduziram de forma significativa a viabilidade celular de células HPV-positivas (HeLa e CaSki) e inibiram a sua proliferação celular. Curiosamente, apenas os compostos CMP50 e CMP11c foram capazes de proteger a p53 da degradação mediada pela proteína E6. Este efeito foi acompanhado por ativação da apoptose de acordo com o aumento de expressão da BAX, da atividade da caspase-3 e da fragmentação do DNA. Além disso, estes dois compostos induziram paragem do ciclo celular na fase G1, concordante com o aumento de expressão do gene p21, bem como redução da capacidade migratória das células HPV-positivas e desintegração nos modelos 3D, esferoides de células HeLa e CaSki. Com o intuito de explorar também a proteína E7 como alvo terapêutico, e tendo em conta as dificuldades inerentes à sua purificação, baseámo-nos nas metodologias estabelecidas para a proteína E6 e otimizamos o processo biotecnológico para obter a proteína recombinante His₆-MBP-E7. Foram comparadas diferentes estratégias cromatográficas baseadas em passos de captura (MBPTrap e HisTrap FF) e de polimento (HisTrap HP e Superdex), tendo-se alcançado elevados rendimentos (~85%) e purezas próximas dos 98%. A análise das frações purificadas por Native-PAGE e espalhamento de luz dinâmico demonstraram a presença de formas monoméricas e oligoméricas da proteína de interesse. Assim, as resinas multimodais e aniónicas tolerantes ao sal foram exploradas numa tentativa de obter apenas a forma monomérica da proteína His₆-MBP-E7 ou como abordagens de polimento alternativas. A resina HyperCel Star AX revelou-se particularmente eficaz na recuperação da proteína His₆-MBP-E7 sob condições suaves e com elevada pureza (98-99%), conforme confirmado por LC-MS/MS. Através do estudo da composição de vários tampões e aditivos, foi identificado que pHs entre 6.0 e 7.0, bem como açúcares e detergentes contribuíram para a estabilidade térmica da proteína de interesse. De facto, o uso de detergentes como η-Decyl-β-D-Maltopyranoside (DM) e η-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) permitiu obter uma amostra de proteína monodispersa e estável. Em suma, o trabalho experimental desenvolvido ao longo desta tese estabeleceu um bioprocesso reprodutível para a produção e purificação das oncoproteínas E6 e E7 do HPV16, que pode ser facilmente adaptado para a obtenção de proteínas de outros tipos de HPV com elevada pureza. Estes resultados mostram o potencial para a sua aplicação em estudos estruturais, funcionais e de biointeração com diferentes moléculas. A combinação de métodos de modelação computacional, acoplados a ensaios de biointeração e ao nível celular, permitiu identificar compostos naturais e sintéticos (de uma biblioteca in house) capazes de inibir especificamente a função oncogénica da proteína E6, induzindo respostas antitumorais em células HPV-positivas. Este trabalho culminou na submissão de pedidos de patente. Além disso, serve de base para o desenvolvimento de novos fármacos mais potentes e específicos, direcionados à infeção por HPV de alto risco e cancro do colo do útero. Paralelamente, abre perspetivas para a utilização destas proteínas recombinantes como ferramentas para a seleção de ligandos e estabilizadores que poderão ser explorados em estudos de cristalografia e cryo-EM, bem como em metodologias de diagnóstico focados na deteção de E6 e E7 como biomarcadores específicos para avaliar a progressão das lesões.engCancro do colo do úteroCompostos naturais e sintéticosEscherichia coliPequenas moléculas inibidorasProdução recombinanteProteína E6Proteína E7PurificaçãoVírus do papiloma humanoCervical CancerE6 proteinE7 proteinHuman PapillomavirusNatural and synthetic compoundsPurificationRecombinant biosynthesisSmall-molecule inhibitorsdoctoral thesis101683464