Bernardino, Liliana InácioFerreira, Lino SilvaEsteves, Marta Raquel Carrola2023-08-282023-07-05http://hdl.handle.net/10400.6/13412Parkinson’s disease (PD), a progressive and chronic neurological disorder characterized by the selective degeneration of the nigrostriatal dopaminergic pathway, has a huge socioeconomic impact in modern society. Alterations in alpha (α)-synuclein protein expression and aggregation have been regarded as a primary cause of dopaminergic neurons death in the substantia nigra (SN) pars compacta. So far, there are no treatments that halt or reverse the progression of PD. Recent evidence showed that microRNAs (miRNA), small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression, are dysregulated in PD patients. In particular, miR-124 levels were found decreased in plasma and postmortem brain parenchyma of PD patients. Thus, miR-124 has become a relevant molecular therapeutic target for PD. Increasing intracellular levels of miR-124 enhances neurogenesis and neuroprotection in PD models. However, the effect of miR- 124 on α-synuclein dynamics has not yet been reported. One of the main goals of this thesis was to evaluate the role of miR-124-3p in the expression and aggregation of α-synuclein protein using the rat model of PD based on the acute administration of paraquat (PQ). The first research work showed that intranigral administration of miR-124-3p significantly reduces the protein levels of α- synuclein and α-synuclein phosphorylated at serine 129 (present in large amounts in Lewy bodies) in the SN of rats exposed to PQ. Moreover, the protein levels of NADPH oxidase 1 (Nox1), responsible for the oxidative stress production and eventually involved in the development of α-synuclein toxicity, and its activator GTPase Rac1, decreased in SN after miR-124-3p administration in PQ-treated rats. Additionally, the reduced levels of Pitx3 in the SN caused by the administration of PQ were found to increase after the administration of miR-124-3p. This work demonstrates for the first time the role of miR- 124-3p in the regulation of α-synuclein toxicity, possibly through the modulation of the Nox1/Rac1 signaling pathway and in the regulation of Pitx3 expression important for the survival and maintenance of dopaminergic neurons. The efficient delivery of miRNA at the intracellular and intracerebral levels has several limitations since they are highly susceptible to degradation by nucleases and are difficult to take up by cells due to their negative charge. Recently, several approaches capable of guaranteeing an efficient delivery of miRNA have been developed. In particular, small extracellular vesicles (sEV), also referred to as exosomes, have been highlighted as efficient delivery systems for miRNA due to their intrinsic ability to interact with cells and tissues. The second main goal of this thesis was to use sEV isolated from human umbilical cord blood-derived mononuclear cells as a biological vehicle of miR-124 and to evaluate the efficiency of these sEV transfected with miR-124-3p (miR-124-3p sEV) in inducing neurogenesis and neuroprotection in 6-hydroxydopamine (6-OHDA) PD model. The second research work showed that in vitro, sEV efficiently deliver miR-124- 3p to subventricular zone (SVZ) neural stem cells (NSC) and to N27 dopaminergic cells. Treatment of NSC with miR-124-3p sEV induced neuronal differentiation of SVZ NSC under physiological conditions and protected N27 dopaminergic cells against 6-OHDAinduced toxicity. In vivo, sEV intracerebroventricularly injected in mice were detected in SVZ lining the lateral ventricles and in striatum and midbrain sections, the brain regions most affected by the disease. Although miR-124-3p sEV did not increase the number of new neurons in the 6-OHDA-lesioned striatum, the formulation protected dopaminergic neurons in the SN and striatal fibers, which fully counteracted motor behavior symptoms in mice administered with 6-OHDA. In conclusion, the results obtained during this thesis provide new evidence on the role of miR-124-3p in α-synuclein protein pathology and evidence supporting the application of sEV as biologic delivery agents for miR-124-3p to promote neuroprotection of dopaminergic neurons. In short, the enrichment of sEV with miR-124-3p may configure a promising therapeutic strategy able to halt or slow-down dopaminergic neuronal death in PD.A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada principalmente por sintomas e complicações motoras. Dados epidemiológicos indicam que a prevalência da DP na população aumenta de cerca de 1% aos 60 anos para 4% aos 80 anos, sendo considerada uma das doenças neurodegenerativas mais prevalente. Ao nível fisiopatológico, esta doença é caracterizada pela degeneração progressiva e acentuada de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra (SN) pars compacta. Esta subpopulação neuronal dopaminérgica é responsável pela produção de dopamina, neurotransmissor envolvido na coordenação motora. A presença de corpos de Lewy nos neurónios dopaminérgicos, agregados citoplasmáticos constituídos principalmente pela proteína alfa (α)-sinucleína, é uma característica patológica da doença. Na DP, a redução nos níveis de dopamina no cérebro leva ao aparecimento dos primeiros sintomas motores que incluem tremor, rigidez e dificuldades de locomoção e de sintomas nãomotores que incluem fadiga, distúrbios do sono e alterações cognitivas. Devido à natureza complexa e multifatorial desta doença, os mecanismos subjacentes à sua patogénese permanecem por elucidar, e por isso ainda não existem tratamentos eficazes que parem ou desacelerem a sua progressão, embora tratamentos como o procedimento cirúrgico de estimulação cerebral profunda (DBS) permitam aliviar os sintomas motores de alguns pacientes. Os microRNA (miRNA) são pequenos ácidos ribonucleicos não codificantes que desempenham um papel importante em diversos processos fisiológicos e patológicos através da regulação da expressão génica após a transcrição. Em particular, os níveis de miR-124, um miRNA expresso abundantemente no cérebro, encontram-se diminuídos em amostras humanas de cérebros post mortem e no plasma de pacientes com a DP e em modelos experimentais in vitro e in vivo da DP. Neste sentido, aumentar os níveis intracelulares de miR-124 no cérebro surge como uma estratégia terapêutica atrativa para a DP. Ao longo dos últimos anos têm sido descritos os efeitos neuroprotetores, neurogénicos e anti-inflamatórios do miR-124 em modelos experimentais da DP. Contudo, desconhece-se o efeito do miR-124 na acumulação e agregação da proteína α- sinucleína, uma das principais características patológicas da DP. Neste seguimento, um dos principais objetivos desta tese de doutoramento foi avaliar o efeito do miR-124-3p na expressão e sinalização associada à proteína α-sinucleína num modelo animal da DP induzido pela administração de paraquat (PQ). No primeiro trabalho apresentado nesta tese, verificou-se que a administração intraperitoneal de PQ aumenta os níveis proteicos da α-sinucleína e da α-sinucleína fosforilada na serina 129, forma modificada envolvida na agregação da α-sinucleína e presente em maior quantidade nos corpos de Lewy. Os resultados obtidos demonstraram que a administração intranigral do miR-124-3p diminui os níveis proteicos totais da α- sinucleína e da α-sinucleína fosforilada na serina 129 na SN de ratos tratados com PQ. Evidências prévias sugerem que a enzima NADPH oxidase 1 (Nox1), responsável pela produção de espécies reativas de oxigénio, favorece a acumulação e agregação da α- sinucleína. Neste sentido, verificou-se que o tratamento com o miR-124-3p promoveu uma diminuição dos níveis proteicos da Nox1 e do seu regulador, a GTPase Rac1, que se encontram aumentados na SN de ratos tratados com o PQ. Adicionalmente, verificou-se que os níveis reduzidos de Pitx3 na SN, fator de transcrição responsável pela regulação da expressão da enzima tirosina hidroxilase e por manter o fenótipo dopaminérgico, provocados pela administração de PQ, aumentaram após a administração de miR-124- 3p. Este estudo demonstra pela primeira vez o papel do miR-124-3p na regulação da toxicidade da α-sinucleína possivelmente através da modulação da via de sinalização Nox-1/Rac1 e na regulação da expressão de Pitx3, importante para a sobrevivência e manutenção dos neurónios dopaminérgicos. Em suma, estes resultados evidenciam a potencial aplicação terapêutica de miR-124 na DP e α-sinucleinopatias relacionadas. Embora os miRNA estejam a ser propostos como possíveis alvos terapêuticos em várias doenças, existem limitações associadas à sua capacidade de internalização nas células ou alcançar os tecidos lesados devido às suas características moleculares (molécula hidrofílica com carga negativa). Neste sentido, várias têm sido as abordagens descritas capazes de potenciar a sua entrega intracelular através de veículos de entrega. Recentemente, a utilização de veículos biológicos, nomeadamente pequenas vesiculas extracelulares (pVE) ou exossomas, como também são comumente designadas, tem atraído a atenção da comunidade científica devido à sua natureza biológica e capacidade eficiente de se incorporarem em células e tecidos. Neste seguimento, o segundo objetivo principal desta tese de doutoramento foi utilizar pVE isoladas de células mononucleares derivadas do sangue do cordão umbilical humano como veículo biológico para a entrega intracelular do miR-124 e avaliar a eficiência das pVE moduladas na neurogénese da zona subventricular e na neuroprotecção de neurónios dopaminérgicos. O segundo trabalho de investigação mostrou que as pVE são capazes de internalizar e entregar eficientemente o miR-124-3p nas células estaminais neurais da zona subventricular e em células dopaminérgicas da linha celular N27, in vitro. O tratamento de células estaminais neurais da zona subventricular com pEV moduladas com miR-124-3p (miR-124-3p pVE) induziu a diferenciação neuronal e protegeu as células dopaminérgicas N27 contra a toxicidade induzida pela toxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). In vivo, as pEV injetadas no ventrículo lateral de murganhos foram detetadas na zona subventricular, que reveste os ventrículos laterais, e em seções cerebrais de estriado e SN, as regiões do cérebro mais afetadas pela doença. Verificou-se que a administração intracerebroventricular de miR- 124-3p pVE não aumentou o número de novos neurónios no corpo estriado de murganhos lesados com a 6-OHDA. Contudo, a formulação foi capaz de proteger os neurónios dopaminérgicos na SN e as fibras estriatais, melhorando significativamente os déficits motores dos murganhos lesados com a 6-OHDA. Em conclusão, os resultados obtidos durante o desenvolvimento desta tese fornecem numa primeira fase, novos dados sobre o papel neuroprotetor do miR-124-3p num contexto da DP, especificamente na modulação da proteína α-sinucleína. Numa segunda fase, os resultados suportam a utilização das pVE como agentes biológicos de entrega de miR-124-3p e o seu enriquecimento com miR-124-3p como uma estratégia promissora capaz de parar ou retardar a morte neuronal dopaminérgica na DP.engmiR-124Alfa-sinucleínaPequenas vesículas extracelularesNeurogéneseNeuroprotecçãoDoença de Parkinsondoctoral thesis101596480