Rosado, Tiago Alexandre PiresAlba, Maria Eugénia GallardoBarroso, MárioSilva, Rodrigo Pelixo da2025-01-282024-11-222024-10-11http://hdl.handle.net/10400.6/15055Ketamine (KET) has emerged as a popular new psychoactive substance in Europe due to the dissociative state it induces. These effects are sought by users at raves, as unprescribed remedies for psychological issues, and in drug-facilitated crimes. Forensic specialists often struggle to identify pathways to prove drug consumption; however, hair offers unparalleled advantages as a sample type that can reveal both chronic consumption and acute abuse, with cutting being the only way to prevent detection. As a complex matrix, hair requires pretreatment to remove interferences and enhance analysis sensitivity. This study employs a miniaturised version of the “Quick, Easy, Cheap, Rugged, and Safe” (QuEChERS) extraction method, commonly used in food and environmental analysis. The method involves the use of 1 mL of 5% formic acid (FA) in acetonitrile (ACN) and 250 mg NH4HCO2 as the solvent and salt partitioning agents, respectively, along with 50 mg of MgSO4 and 10 mg of PSA in the dispersive solid-phase extraction step. After this clean-up, the samples were analysed via gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Following optimisation, the method was validated for the main drug and its primary metabolite, norketamine (NKET). A limit of detection (LOD) of 0.01 ng/mg was achieved for KET and 0.8 ng/mg for NKET, with a limit of quantification (LOQ) of 0.05 ng/mg and 0.8 ng/mg, respectively. Consequently, a working range of 0.05–5 ng/mg was established for KET, and 0.8–5 ng/mg for NKET. The recovery rates ranged from 47–76% for KET and 14–27% for NKET. Following this step, the method was applied to authentic samples collected from consumers. The µ-QuEChERS method proved to be a sustainable clean-up technique, maintaining the QuEChERS parameters despite its miniaturisation, and achieved high sensitivity, surpassing the cut-off value of 0.2 ng/mg established by the Society of Hair Testing.A ketamina (KET) foi sintetizada no início dos anos 60 na busca de um agente anestésico seguro que não provocasse depressão respiratória nem efeitos psicológicos graves. Contudo, após a sua utilização em larga escala na guerra do Vietname, a droga tornou-se popular nas ruas dos EUA. A KET surgiu como uma nova substância psicoativa na Europa devido ao estado dissociativo que induz, ao bloquear recetores do sistema glutamatérgico de forma não competitiva. Estes efeitos são procurados por consumidores em festas de música eletrónica e por doentes com problemas psicológicos que utilizam a droga como medicação não prescrita. Tem também sido detetada em situações de submissão química (crimes facilitados por administração sub-reptícia de drogas) devido a estes mesmos efeitos. Devido à natureza dos casos, os especialistas forenses por vezes têm dificuldade em provar inequivocamente o consumo de determinada droga; neste sentido, o cabelo oferece importantes vantagens como amostra, já que permite revelar o consumo crónico das substâncias, além da utilização pontual. Uma das vantagens que apresenta é o facto de que a abstinência de consumo não remove as substâncias que já se encontram incorporadas. Tratando-se de uma matriz complexa, o pré-tratamento da amostra é crucial devido à abundância de interferentes, e uma etapa de concentração é necessária para melhorar a sensibilidade da análise. Este estudo consistiu no desenvolvimento e otimização de uma versão miniaturizada do método de extração “Quick Easy Cheap Rugged and Safe” (QuEChERS), utilizado em análises de alimentos e ambientais para a deteção de resíduos de pesticidas, sendo o método oficial para este fim na Europa e EUA. O método consiste numa partição em dois passos de forma a retirar a maior quantidade de interferentes possíveis, isolando os analitos dos componentes da matriz. Neste caso foi desenvolvido e utilizado como processo de “clean-up” para determinação de KET em amostras de cabelo. Inicialmente, foram escolhidos os componentes de partição do passo inicial de “salting-out”. Para isso foram analisadas as respostas obtidas ao utilizar como sais o MgSO4 em conjunto com NaOAc, o NH4OAc e NH4HCO2 tendo sido escolhido este último. Para os solventes de partição do mesmo passo, foram estudados o acetonitrilo (ACN), 1% de ácido acético em ACN e 5% ácido fórmico (FA) em ACN, tendo sido selecionado o último. Foi também selecionada a amina primária secundária (PSA) como sorbente para o passo de extração em fase sólida dispersiva (d-SPE) devido às suas interações com múltiplas macromoléculas. Após seleção dos componentes, o método foi otimizado com recurso ao Desenho Experimental (DOE), tendo sido testadas várias quantidades dos diferentes componentes de partição, onde finalmente foram selecionadas as menores quantidades de cada, obtendose desta forma um método miniaturizado. Após todas as etapas de otimização o método final foi o seguinte: procedeu-se à descontaminação de uma amostra de cabelo com metanol, água desionizada e diclorometano. Depois de seco e cortado devidamente, 50 mg da amostra foram incubados overnight com metanol, que foi posteriormente decantado para um tubo e evaporado à secura sob corrente de azoto. O extrato foi reconstituído com 1 mL tampão fosfato a 0,1M pH 5,5 e de seguida aplicado o método µ-QuEChERS. Este utiliza no passo inicial de “salting-out” 1 mL de FA a 5% em ACN e 250 mg de NH4HCO2. Após agitação e centrifugação, ao sobrenadante foram adicionados 50 mg de MgSO4 e 10 mg de PSA para a etapa de d-SPE, concluída com nova agitação e centrifugação. Após a recolha do sobrenadante e evaporação, o extrato foi reconstituído em metanol e analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em tandem. Após a etapa de otimização, o método foi validado conforme as guidelines da ANSI/ASB para a KET e para o metabolito primário norketamina (NKET), Foram obtidos limites de deteção (LOD) de 0,01 ng/mg e 0,8 ng/mg, para a KET e NKET. Obteve-se linearidade entre 0,05–5 ng/mg e 0,8-5 ng/mg com coeficientes de determinação superiores a 0,99 para a KET e NKET, respetivamente. Esta linearidade incluiu o valor de “cut-off” de 0,2 ng/mg definido pela Society of Hair Testing, o que torna o método capaz de ser aplicado a rotina laboratorial. O método µ-QuEChERS provou ser uma técnica de clean-up sustentável, mantendo os parâmetros do QuEChERS apesar da miniaturização, alcançando também alta sensibilidade.engµ-QuechersAnálise ForenseCabeloKetaminaPré-Tratamento da Amostramaster thesis203830415