Valente, Joana Filipa Abreu PereiraSousa, Ângela Maria Almeida deAlves, Nuno Manuel FernandesLopes, Guilherme Zoccal Rossignoli Lopes2025-11-132025-11-132025-07-17http://hdl.handle.net/10400.6/19226Cervical cancer (CC) is one of the leading causes of mortality among women worldwide and is strongly associated with persistent infection by the Human Papillomavirus (HPV). Despite advances in prevention through vaccination and screening, developing countries still have limited access to preventive healthcare, making CC a significant public health issue. The primary cause of this type of tumor is the oncogenic action of the E6 and E7 oncoproteins, encoded by the HPV genome. The viral E6 protein promotes the degradation of the tumor suppressor protein p53, essential for maintaining cellular integrity, thereby inhibiting apoptosis. Meanwhile, the E7 protein inactivates the retinoblastoma protein (pRb), leading to uncontrolled cell proliferation and tumor progression. Although advances have been made in prevention and treatment, innovative therapeutic approaches are still needed to enhance efficacy and mitigate the adverse effects of conventional treatments, such as surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Concerning the above mentioned, this dissertation focuses on developing a 3D-printed (3DP) vaginal insert made of polycaprolactone (PCL) that will work as a platform for gene and drug delivery to treat HPV-induced CC. The dosage form (DF) presents an interconnected porous structure filled with alginate hydrogels, enabling the controlled release of therapeutic agents. Among the compounds incorporated into the template, there are the taxifolin (TAX), a flavonoid that exhibits selective cytotoxicity toward cells expressing the viral E6 protein, and the p53 encoding plasmid DNA (pDNA), intended to restore apoptotic pathways. The formulation was engineered to achieve a dual-release profile: TAX, embedded in 0.75% alginate, demonstrated a rapid release, whereas pDNA, embedded in 2% alginate, exhibited a sustained release over time. Characterisation studies, including thermal, chemical, mechanical, and morphological analyses were conducted to evaluate the system’s structural integrity and functional behaviour. Moreover, different alginate concentrations were studied to achieve different release profiles. This was an important step since it was important to guarantee that the drug has a quick effect on cancer cells while pDNA should have a prolonged therapeutic effect. Moreover, these experiments were performed under different pH conditions, simulating both the physiological environment (pH 7.4) and the tumor microenvironment (pH 5.8). To understand the drug release kinetics and compare the different sodium alginate concentrations used, several mathematical models were fitted to the experimental data. The obtained results of this dissertation demonstrate that additive manufacturing (AM) is a promising tool for developing personalised DF. The vaginal insert designed herein successfully exhibited a dual-release profile, combining the rapid release of TAX with the sustained release of pDNA, potentially enabling a more effective and localized treatment strategy for CC. Significant differences were observed in the release behaviour depending on both the alginate concentration and the pH of the surrounding medium. Overall, it was possible to achieve an ovule-shaped 3DP platform for vaginal administration, featuring an interconnected porous structure that was subsequently filled with alginate hydrogel. A dual-release effect with distinct profiles was achieved by modulating the hydrogel network density. Variations in alginate crosslinking enabled fine control over the release kinetics: TAX, incorporated into 0.75% alginate, exhibited a rapid release within the first 6 h, while pDNA, incorporated into 2% alginate, showed a prolonged and controlled release during the later stages of the study. Future research should focus on the biological validation of the system in cellular models to confirm its efficacy in the tumor microenvironment. Additionally, further studies could optimise the formulation and explore the incorporation of other therapeutic agents, broadening the applications of this technology for other gynecological diseases.O cancro do colo do útero é uma das principais causas de mortalidade entre mulheres em todo o mundo, sendo fortemente associado à infeção persistente pelo Papilomavírus Humano (HPV). Apesar dos avanços na prevenção por meio da vacinação e do rastreamento, os países em desenvolvimento ainda possuem acesso limitado à saúde preventiva, sendo o cancro do colo do útero ainda um grande problema de saúde pública. A principal causa desse tipo de tumor é a ação das oncoproteínas E6 e E7, codificadas pelo genoma do HPV. A proteína viral E6 promove a degradação da proteína p53, um supressor tumoral essencial para a manutenção da integridade celular, favorecendo a inibição da apoptose, e a E7 apresenta a capacidade de inativação da proteína do retinoblastoma, gerando um descontrole da proliferação celular, e, portanto, favorecendo a progressão tumoral. Embora tenha surgido avanços na prevenção e no tratamento, abordagens terapêuticas inovadoras ainda são necessárias para melhorar a eficácia e reduzir os efeitos adversos dos tratamentos convencionais, como cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Nesta dissertação, foi desenvolvido uma forma farmacêutica, impressa em 3D, de libertação controlada de fármacos, voltada para o tratamento do cancro do colo do útero induzido por infeção persistente por HPV. O sistema consiste em um óvulo vaginal de policaprolactona (PCL), um polímero biocompatível e biodegradável. A forma farmacêutica apresenta uma estrutura porosa interconectada preenchida com hidrogéis de alginato. A escolha do fabrico aditivo como tecnologia de produção permite a personalização do tratamento assim como do dispositivo, garantindo a obtenção do formato desejado para a forma farmacêutica e um controle sobre a cinética de libertação dos fármacos. Foram incorporados ao sistema a Taxifolina (TAX), um flavonoide que demonstra citotoxicidade seletiva para células que expressam a proteína viral E6 do HPV; e DNA plasmídico (pDNA), contendo o gene p53. A formulação foi projetada para permitir um perfil de libertação dual, no qual a TAX, incorporada em alginato 0,75%, apresenta uma libertação rápida e, o pDNA incorporado em alginato 2% é libertado de forma prolongada. Essa estratégia visa um efeito sinérgico entre a ação da TAX em inibir a ação da oncoproteína E6 e a restauração da atividade do gene p53 no ambiente tumoral, contribuindo para a apoptose seletiva de células cancerígenas. Para garantir a viabilidade do sistema, foi estabelecida uma série de estudos de caracterização. A caracterização térmica, realizada por Análise Térmica Simultânea, avaliou a estabilidade térmica do PCL antes e depois do processo de impressão, demonstrando que o material mantém as suas propriedades estruturais mesmo após o processo de extrusão. A análise mecânica da estrutura de PCL, por meio de ensaios de compressão e flexão em três pontos, indicou que o inserto vaginal apresenta flexibilidade e resistência, garantindo que o dispositivo possui características adequadas para a sua aplicação. A caracterização morfológica, conduzida por Microscopia Eletrónica de Varredura e Microtomografia Computadorizada, confirmou a presença de poros interconectados na forma farmacêutica, essenciais para a difusão dos fármacos. Os ensaios de eficiência de incorporação mostraram altas taxas de incorporação de pDNA nos hidrogéis de alginato, bem como altas taxas de eficiência de incorporação de TAX e pDNA na forma farmacêutica impressa em 3D, garantindo um processo eficiente de carregamento dos fármacos. Os estudos de libertação in vitro foram realizados em diferentes condições de pH, simulando tanto o ambiente fisiológico (pH 7,4), quanto o microambiente tumoral (pH 5,8). Inicialmente, para comprovar a mudança no perfil de libertação conforme a alteração das concentrações de alginato, foram realizados estudos de libertação nos hidrogéis contendo pDNA incorporado em alginato 0,75% e 2%. Os resultados apresentaram uma modificação considerável nos perfis de libertação de acordo com a alteração nas concentrações de alginato bem como no pH do meio. Posteriormente, os resultados mostraram que a libertação da TAX (alginato 0,75%) na forma farmacêutica impressa em 3D ocorreu rapidamente, principalmente dentro das primeiras 6 h, enquanto o pDNA (alginato 2%) foi libertado de forma retardada ao longo das últimas horas de estudo, confirmando a eficácia do sistema em modular a cinética de libertação dos ativos. A validação do processo de incorporação e libertação foi realizada por eletroforese em gel de agarose, demonstrando a ausência de pDNA após o processo de incorporação e a presença de pDNA nas amostras coletadas. Para compreender a cinética de libertação dos fármacos e comparar com as diferentes concentrações de alginato de sódio utilizados, diferentes modelos matemáticos foram ajustados aos dados experimentais. Os resultados desta dissertação demonstram que o fabrico aditivo é uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de formas farmacêuticas personalizadas. O óvulo vaginal desenvolvido apresentou um perfil de libertação dual eficiente, combinando a ação rápida da TAX com a libertação retardada do pDNA, o que pode contribuir para um tratamento mais eficaz e localizado do cancro cervical. Futuras investigações devem focar na validação biológica do sistema em modelos celulares para confirmar a sua eficácia no ambiente tumoral. Além disso, estudos adicionais podem otimizar a formulação e explorar a possibilidade de incorporar outros ativos terapêuticos, ampliando as aplicações desta tecnologia para outras patologias ginecológicas.engCancro do Colo do ÚteroDNA PlasmídicoHPVFabrico AditivoTaxifolinaAdditive ManufacturingCervical Cancerp53 encoding pDNATaxifolinmaster thesis204027829