Socorro, Sílvia Cristina da Cruz MarquesSantos, Cecília Reis Alves dosMarques, Ricardo Jorge Fernandes2016-06-292016-06-292016-02http://hdl.handle.net/10400.6/4214O cancro da mama é uma doença heterogénea que compreende uma grande variedade de alterações moleculares e diferentes tipos de resposta em termos clínicos. Esta diversidade reside nos múltiplos fatores que podem levar à transformação maligna das células, em consequência da desregulação de diferentes processos fisiológicos. A regucalcina (RGN) é uma proteína de ligação ao cálcio (Ca2+) e cuja principal função conhecida é regular a homeostase do Ca2+ intracelular, mas podendo também estar envolvida na regulação da proliferação celular, apoptose e metabolismo das células. A RGN também foi identificada como um gene regulado por hormonas, incluindo os esteroides sexuais como os androgénios. Para além disso, foi anteriormente associada a determinadas patologias e tendo mesmo sido identificada como uma proteína subexpressa em casos humanos de cancro da mama, próstata ou fígado. No fígado, a subexpressão da RGN foi detetada em lesões pré-neoplásicas, ou seja, antes da aquisição do fenótipo neoplásico, o que sugere que a sua diminuição pode estar ligada ao início do processo de transformação tumorigénico. Apesar destas evidências, os mecanismos moleculares subjacentes às funções da RGN na mama permanecem por identificar. Nesta tese, colocámos a hipótese de que a sobreexpressão da RGN poderá exercer uma ação protetora em relação à carcinogénese mamária. De modo a avaliar esta questão, o composto 7,12 dimetilbenz[α]antraceneno, o qual é conhecido por induzir carcinogénese mamária em rato, foi administrado a ratos transgénicos que sobreepressam a RGN (Tg-RGN) e aos respetivos controlos (Wt, do inglês wild-type). Os ratos Tg-RGN apresentaram, notavelmente, uma menor incidência de tumores (25.8 %) comparativamente aos animais controlo (100 %). A classificação histológica também demonstrou uma clara resistência dos ratos Tg-RGN à tumorigénese, ao serem bastante mais resistentes à progressão dos tumores para estadios mais agressivos. Verificou-se uma muito menor percentagem de tumores do tipo invasivo nos animais transgénicos (3.8 % vs 45.8 % nos Wt). Para além disso, foi observado um aumento da atividade proliferativa nos tumores não-invasivos nos Wt comparativamente aos animais TG-RGN, o que indica a menor capacidade invasiva. A avaliação metabólica dos tumores benignos da glândula demonstrou que os tumores de ratos Tg-RGN possuem uma menor expressão e atividade da lactato desidrogenase (LDH), característica que normalmente se encontra associada a uma restrição da progressão tumoral e a um decréscimo da agressividade. Contudo, em tecido mamário não-neoplásico de ratos Tg-RGN observou-se uma restrição do metabolismo glicolítico, o que é indicativo de uma redução dos níveis energéticos no tecido. Estes resultados podem ser de extrema importância para a diminuição da proliferação celular e constituir um mecanismo adicional, pelo qual a RGN previne o desenvolvimento tumoral. De facto, a sobreexpressão da RGN originou uma diminuição da expressão de genes envolvidos na regulação ciclo celular e de oncogenes na glândula mamária de ratos Tg-RGN. Mais ainda, a expressão do P53 e a atividade da caspase-3 também foi encontrada aumentadas concomitantemente com a sobreexpressão da RGN, o que sugere uma ação protetora da RGN no aparecimento do tumor, a qual pode ser mediada também pela regulação das vias apoptóticas. Em contrapartida, a expressão da RGN em células MCF-7 de cancro da mama diminui pela ação do androgénio não-aromatizável 5α-dihidrotestosterona, ao passo que a expressão do canal de Ca2+ do tipo L aumentou. Estes resultados sustentam a diminuição da viabilidade celular evidenciada nestas células e sugerem o envolvimento destes modeladores do Ca2+ no controlo da proliferação celular mamária, o que no caso do canal de Ca2+ do tipo L nunca antes tinha sido sugerido. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese destaca a preponderância da RGN numa diversidade de mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos na glândula mamária. As evidências biológicas aqui apresentadas confirmam o papel protetor da RGN na carcinogénese mamária, ao restringir processos biológicos reconhecidos como fundamentais para o desenvolvimento do cancro, nomeadamente, a proliferação celular e as alterações no metabolismo celular, ao mesmo tempo que aumenta a morte celular por apoptose.Breast cancer is a heterogeneous disease that comprises a wide variety of molecular alterations and divergent clinical behaviors. This diversity resides in a plethora of factors that can drive cell malignant transformation, by the deregulation of basic physiological pathways that are recognized as the cancer hallmarks. Regucalcin (RGN) is a calcium (Ca2+)-binding protein known to play an important role in intracellular Ca2+ homeostasis, but it is also involved in the regulation of multiple intracellular signaling pathways such as cell proliferation, apoptosis and metabolism. RGN also has been identified as a hormonally regulated gene, which includes the sex steroids androgens. Furthermore, RGN was previously associated with pathological conditions and described as a protein underexpressed in human breast, prostate and liver cancer cases. In the liver, it was demonstrated that RGN underexpression occurs in pre-neoplastic lesions before the acquisition of neoplastic phenotype, which thus implicates RGN loss in the tumorigenic transformation. In spite of this evidence, the molecular mechanisms underlying RGN actions in the breast remain to be identified. In the present thesis, we hypothesized that RGN overexpression may exert a protective action against mammary tumorigenesis. To address this issue, transgenic rats overexpressing RGN (Tg-RGN) and wild-type (Wt) controls were treated with 7,12-dimethylbenz[α]anthracene, a compound recognized to induce carcinogenesis of rat mammary gland. Tg-RGN rats displayed a remarkable lower incidence of tumors (25.8 %), comparatively with their Wt counterparts (100 %). Tumor histological classification also clearly showed that Tg-RGN rats are resistant to cancer progression into more aggressive stages, as indicated by the lower percentage of invasive tumors types (3.8 % vs 45.8 % in Wt). Moreover, higher proliferative activity was observed in non-invasive tumors of Wt comparatively with those of Tg-RGN animals. The metabolic evaluation of these tumors demonstrated a lower expression and activity of lactate dehydrogenase (LDH) in Tg-RGN rats, which is a feature associated with restricted tumor progression and lower aggressiveness. Notwithstanding, in the non-neoplastic mammary gland of Tg-RGN rats a restriction of the glycolytic metabolism was observed, which indicates a reduction of the energy levels in the tissue. These results may be quite relevant to slowdown cell proliferation, and may constitute an additional mechanism by which RGN prevent tumor development. Indeed, RGN overexpression suppressed the expression of cell cycle regulators and oncogenes in the mammary gland of Tg-RGN rats. Besides that, P53 expression and caspase-3 activity were also augmented in response to RGN overexpression, which suggests that the protective role of RGN against tumor onset may also be mediated by the modulation of apoptotic pathways. On the other hand, RGN and L-type Ca2+ channel were found to be down-regulated and up-regulated, respectively, by the non-aromatizable androgen 5α-didydrotestosterone in MCF-7 breast cancer cells. These results underpinned the decreased viability of MCF-7 cells and suggest the involvement of Ca2+ regulators, RGN and L-type Ca2+ channels, in the control of breast cell proliferation. In conclusion, the work presented in this thesis highlighted the influence of RGN in a plethora of physiologic and pathophysiologic mechanisms of the mammary gland. The biologic evidence presented herein confirmed the protective role of RGN in mammary carcinogenesis, by restraining biological processes recognized as the hallmarks of cancer, namely, cell proliferation and metabolism, or by enhancing apoptotic cell death.engApoptoseCancro da mamaGlândula mamáriaMetabolismo glicolíticoProliferaçãoRegucalcinaTg-RGNApoptosisBreast cancerGlycolytic metabolismMammary glandProliferationRegucalcindoctoral thesis101378238