Cascalheira, José Francisco da SilvaSebastião, Ana MariaNogueira, Vanda Cristina Simões2020-12-032020-12-032020-05-082020-02-21http://hdl.handle.net/10400.6/10537Glioblastoma is a primary brain tumor of glial cells with a high incidence in adults and is one of the most abundant brain cancer pathologies. This type of tumor is associated with high genomic instability caused by global hypomethylation of the DNA, that induces activation of oncogenes, loss of imprinting and increased genomic instability. Adenosine is a purine nucleoside important to neuroprotection, neuromodulation, synaptic plasticity and immunomodulation. In hypoxic and stress regions in the brain tumors, commonly found in glioblastoma, factors induced by hypoxia (HIF) are activated. These factors modulate the expression of different proteins, particularly the CD39 and CD73. These enzymes are involved in the metabolism of adenosine, increasing the formation of this nucleoside extracellularly. Increased extracellular levels of adenosine lead to increased adenosine uptake into the cell by nucleoside transporters, producing accumulation of intracellular adenosine. Increased intracellular levels of adenosine or homocysteine lead to an increase of Sadenosylhomocysteine (SAH) levels and a decrease of the S-adenosylmethionine (SAM)/SAH ratio, since the reaction of adenosine with homocysteine to give SAH, catalyzed by SAH hydrolase, is near equilibrium. SAH is a competitive inhibitor of SAMdependent methyltransferases, its accumulation causing global hypomethylation of DNA. The O-6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) is a DNA repair protein whose function is to remove methyl groups from the guanines in DNA. Although, very different mutations can cause the lack of MGMT expression, the hypermethylation of MGMT gene promoter is the main responsible for this. Early mutations in glioblastoma frequently lead to hypermethylation in the MGMT gene promoter, which causes gene silencing and lack of expression of the MGMT DNA repairing protein. It is known that the expression of this tumor suppressor protein is responsible for the lack of glioblastoma’s sensitivity to available first-line treatment, the alkylating drug Temozolomide (TMZ). TMZ is an alkylating agent used in glioblastomas treatment, usually combined with radiotherapy. However, the success of this agent is very low, above 20 % response rat, and the prognosis of the glioblastoma patients around one year. The TMZ effect is influenced by several factors inside the cell, like DNA mismatch repair system, MGMT expression, and base excision repair system. The expected final effect of TMZ is the apoptosis of the glioblastoma cells. Another important effect is the acquired resistance which happens after the first treatment with TMZ in many patients. In vitro, different mechanisms became active after a first TMZ treatment, like an increase of MGMT expression and mutations in the DNA mismatch repair system proteins. The aim of this study is to understand if there is a relationship between the increased intracellular adenosine, associated with global hypomethylation of DNA, and the chemotherapeutic resistance to TMZ caused by an increased in MGMT expression and activity. Three glioblastoma cell lines, U87, U373, and SNB19 were used. Intracellular adenosine levels were increased by incubating cells for 72h with ABT 702 dihydrochloride (ABT, 15µM), an adenosine kinase inhibitor. TMZ (100 and 500 µM) was added for the last 1, 2, 3, 24 and 48 hours of incubation. MGMT expression and localization were visualized by immunocytochemistry and western blot, respectively. Cell viability/proliferation was assessed by CCK8 assay. The results by western blot analysis showed that increased levels of adenosine do not affect MGMT expression. A decrease in cell viability/proliferation was observed after treatment with ABT in U373 cell line. After immunocytochemistry against active caspase 3, a marker of cell apoptosis, it was possible to see that the decrease of cells number produced by ABT is due to a decrease in cell proliferation and not cell apoptosis. TMZ (500 µM) was able to decrease the cell viability/proliferation in SNB19 and U373 cell lines. We prove by immunocytochemistry that this effect involves cell death mechanisms mediated by caspase 3 activation, like apoptosis. The combined treatment with TMZ plus an inhibitor of MGMT, we visualized a more accentuated effect on cell survival, but the relative effect of TMZ was not affected because the inhibitor causes its own cytotoxicity. Increasing levels of adenosine with ABT did not modified the TMZ effect on cell survival in U373 cell line, but in SNB19 cell lines seems to be a recovery of cell survival after combined treatment with ABT and TMZ.O Glioblastoma é o tipo de tumor cerebral mais comum e mais agressivo do sistema nervoso central. Constitui 60 a 70% de todos os gliomas. Este tipo de tumores englobam um conjunto de caraterísticas próprias. Apresenta elevada quimiorresitência através da ativação do sistema MRD (sistema de resistência a múltiplas drogas) e aumento da expressão de transportadores ABC que facilitam a expulsão de agentes externos à célula. São encontrados no interior do tecido tumoral vários nichos com subpopulações celulares de células tipo-estaminal de glioblastoma (GSC - “Glioblastoma Stem-like Cells”), que conferem alta capacidade tumorigénica e de quimiorresistência. As GSC encontrarem-se principalmente em zonas de hipoxia e apresentam uma elevada capacidade de autorrenovação, diferenciação celular e propagação. O glioblastoma é designado comumente como um glioma de grau 4 por apresentar características próprias que o diferem de outros tumores cerebrais, como a elevada taxa de proliferação, grande capacidade de invasão, heterogeneidade celular com vários tipos de células e diferentes graus de diferenciação, elevada angiogénese e extensas áreas de necrose. O tempo médio de sobrevivência de um paciente com glioblastoma ronda os 12 meses, sendo que o tratamento padrão passa por recessão cirúrgica, radioterapia e quimioterapia com agentes alquilantes, principalmente. Pesquisas de novas terapias têm surgido tendo como alvo a inibição de proteínas das vias de sinalização que regulam o estado de hipoxia. Por análise de transcriptoma identificaram-se quatro subtipos de glioblastomas de alto grau, sendo eles o pré-neural, neural, clássico e mesenquimal. Cada subtipo apresenta um perfil clínico próprio sendo o mesenquimal o mais agressivo e com mais potencial tumorigénico. Nestes tumores a formação de novos vasos sanguíneos ocorre lentamente, limitando a distribuição de oxigénio e nutrientes nas células. É esta a principal causa das longas áreas de necrose e hipóxia que contribuem para um mau prognóstico da doença. Em condições fisiológicas normais a pressão de oxigénio mantêm-se no intervalo de 20- 100 mm Hg, quando as pressões descem abaixo desse intervalo considera-se estado de hipoxia moderado. Se a pressão for inferior a 4 mm Hg é considerado um estado celular de hipoxia severa. Contribuindo para este estado está ainda o facto de o fluxo sanguíneo no interior do tumor não ser contínuo, acontecendo oscilações de estado normal, hipoxico moderado ou hipoxico severo. O estado de hipoxia controla a expressão de vários factores essenciais para a sobrevivência tumoral, instabilidade genómica, invasão, metástases e metabolismo celular. Esta regulação acontece pela activação de factores de transcrição induzidos por Hipóxia (FIH), existindo três tipos de FIHs (1a, 2a e 3a). Com a diminuição dos níveis de oxigénio torna-se possível a ligação dos FIHs aos elementos de resposta a hipóxia (ERHs) iniciando a transcrição de diversos genes. Consoante o tipo de hipóxia são ativados diferentes tipos de FIHs e a resposta celular é diferente, por exemplo, a ativação do HIF1a tem como alvo enzimas glicolíticas enquanto que o HIF2a atua em proteínas de invasão. O HIF 1a é o que tem o maior nível de expressão no glioblastoma e atua sobre-expressando ectonucleotidases como a CD39 e CD73. Por sua vez, a enzima CD39 contribui para a hidrólise do ATP a AMP e CD73 pela formação de adenosina a partir do AMP. Assim, a sobre-expressão da CD39 e CD73 provoca um aumento de adenosina extracelular. O aumento dos níveis extracelulares de adenosina conduz ao aumento da passagem desta para o interior da célula através dos transportadores de nucleósidos. A adenosina é um nucleósido envolvido na homeostase do metabolismo energético e de ácidos nucleicos e do ciclo de metionina, produz proteção contra insultos neurotóxicos e plasticidade sináptica. A maioris das acções da adenosina são mediadas por activação de receptores de adenosina acoplados a proteína G (A1, A2A, A2B e A3). A concentração deste nucleósido em zonas hipoxicas, esquémicas, tumorais e inflamatórias aumenta cerca de cem vezes relativamente às concentrações fisiológicas. A ação da adenosina mediada pelos receptores em glioblastoma, não é consensual, sendo que em muitos trabalhos é referido um papel anti-apoptotico e noutros, pelo contrário, ações pró-apoptoticas. Novas evidências sugerem que a adenosina também pode atuar por mecanismos intracelulares independentes dos receptores. A adenosina é removida por acção da cinase da adenosina, que catalisa a fosforilação desta a AMP, e pela desaminase da adenosina, qua catalisa a hidrólise da adenosina a Inosina. Intracelularmente a adenosina é formada pela hidrólise do AMP a adenosina catalisada pela 5-nucleotidase. Outra via para a sua formação é mediada pela ação da hidrolase da S-adenosilhomocisteína (SAH) que converte Sadenosilhomocisteína em adenosina e homocisteína. A reacção catalisada pela hidrolase da S-adenosilhomocisteína encontra-se em equilíbrio rápido e, como tal, um aumento de adenosina ou homocisteína conduz ao rápido excesso de S-adenosilhomocisteína. Por sua vez, a S-adenosilhomocisteína é um potente inibidor das transmetilases dependentes de S-adenosilmetionina (SAM), o principal doador de grupos metilo nas células. Os grupos metilo estão envolvidos numa das principais modificações covalentes que ocorrem a nível genético nas células, a metilação. Vários trabalhos têm suportado a hipótese de o aumento intracelular de adenosina poder causar uma hipometilação global do ADN nas células. A diminuição da metilação do DNA é uma das principais características do glioblastoma causando instabilidade genómica e perda de “imprinting”, em muitos casos conduzindo à diminuição da expressão de proteínas próapoptoticas e por outro lado à sobre-expressão de proteínas que contribuem para a progressão tumoral. A relação entre a adenosina e o metabolismo dos grupos metilo pode contribuir para perceber mecanismos promotores-tumorais neste tipo de tumor. A metilação do DNA ocorre em locais específicos chamados “ilhas CpG”. No entanto, apesar de se observar uma hipometilação global do DNA no glioblastoma, pode ocorrer hipermetilação local na região promotora de alguns genes específicos. Esta característica dos gliomas confere-lhes a capacidade de bloquear algumas proteínas supressoras de tumor como por exemplo a metiltransferase da O6-metilguanina (MGMT). A MGMT é uma proteína reparadora de DNA cuja sua função é remover grupos alquilo da posição O6 das guaninas sendo que esta é a principal lesão que acontece a nível genético nas células. 60 a 85% dos gliomas apresenta perda local do cromossoma 10 onde está localizado o gene que codifica para a MGMT. Por outro lado, em 45 a 70% dos gliomas o promotor do gene MGMT encontra-se hipermetilado não permitindo a transcrição do gene e expressão da proteína. O tratamento quimioterapêutico padrão aplicado a glioblastomas baseia-se em agentes alquilantes. Embora este tipo de tratamento já tenha sido imensamente estudado e otimizado ainda apresenta taxas de sucesso demasiado baixas. O temozolomide (TMZ) é um agente quimioterapêutico de primeira linha no tratamento de glioblastoma, o qual apresenta uma taxa de sucesso de apenas 20%. A ação do TMZ baseia-se na adição de grupos metilo nas posições O6 e N7 das guaninas e N3 das adeninas, sendo que a mais agressiva para a célula é a adição na posição O6 da guanina produzindo O6- metilguanina. Este tipo de lesão deveria, em condições normais, acionar o sistema de reparação de mismatch do ADN (MMR). Esta ativação do sistema MMR deveria causar elevada citotoxicidade para a célula e terminar em apoptose. No entanto, em células com expressão de MGMT, o TMZ não consegue exercer qualquer função pois sempre que é adicionado um grupo metilo na posição O6 das guaninas este é imediatamente retirado e a lesão do ADN deixa de existir. Esta é a principal causa de resistência aos tratamentos alquilantes, principalmente porque parecem haver mecanismos que conseguem reativar a expressão de MGMT depois de um tratamento com agentes alquilantes, o que é comumente chamado como resitência adquirida e uma das principais causas da tão pouca taxa de sobrevivência destes pacientes. Por outro lado, mesmo que não exista qualquer expressão da proteína MGMT, se o sistema MMR não estiver funcional também não é acionado qualquer mecanismo que cause citotoxicidade na célula, mais grave ainda é que muitas proteínas que fazem parte deste sistema deixam de estar funcionais depois de um primeiro tratamento com TMZ. O objetivo deste trabalho consistiu em perceber, por um lado, se a adenosina tem algum efeito nos níveis de expressão de MGMT, uma vez que a possível hipometilação global do ADN causada pelo aumento da concentração de adenosina poderá afetar o nível de metilação do promotor do seu gene. Por outro lado pretende-se estudar se ao aumentar os níveis de expressão da MGMT, a adenosina diminuirá o efeito citotóxico do temozolomide em glioblastoma. Para tal incubaram-se durante 3 dias linhas celulares de glioblastoma, na presença de um inibidor selectivo da cinase da adenosina, o ABT 702, e na presença ou na ausência de temozolomide. O ABT 702 qual promove o aumento da concentração da adenosina endógena por inibição da sua degradação. Foram estudadas 3 linhas de glioblastoma: U87, SNB19 e U373. Os níveis de expressão de MGMT foi analisado por Wester Blot e a sobrevivência/proliferação celular foi analisada pelo método do CCK-8. Os resultados mostraram que o ABT 702 (15 µM) não afetou a expressão dos níveis de MGMT em nenhuma das linhas. No entanto o ABT 702 mostrou reduzir proliferação celular em células U373. Por outro lado, foi importante avaliar qual a resposta das células ao agente quimioterapêutico TMZ. O TMZ (500 µM) diminuiu a sobrevivência/proliferação celular nas células U373 e SNB19 mas não nas U87. Em condições de concentrações de adenosina aumentada o efeito do TMZ na viabilidade/proliferação celular não sofreu alteração nas células U373, embora fosse observada uma tendência para diminuição do efeito do TMZ na células SNB19. Por último, era importante saber se a diminuição da sobrevivência celular, avaliada pelo ensaio CCK8, produzida por condições de adenosina aumentada, por tratamento com ABT 702, e produzida tratamento com TMZ, envolviam o mesmo mecanismo. Por immunocitoquímica foi possível avaliar que a diminuição celular causada pelo incremento de adenosina não envolve mecanismos de morte celular, enquanto que a diminuição celular após tratamento com TMZ deve-se a mecanismos apoptoticos, tal como descrito na literatura.engAdenosinaGlioblastomaMethyltransferaseO-6-Methylguanine-DnaTemozolomidemaster thesis202544796