Browsing by Author "Alves, Ana Catarina Natividade"
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- Avaliação da atividade anti-Arcobacter de complexos de inclusão com resveratrol e ciclodextrinasPublication . Alves, Ana Catarina Natividade; Ferreira, Susana; Silva, Filomena Augusta Almeida egénero Arcobacter tem atualmente 18 espécies descritas, das quais se destaca a espécie A. butzleri, uma vez que esta é atualmente considerada um agente enteropatogénico zoonótico emergente tanto para animais como para humanos. Este microrganismo é geralmente detetado em produtos de origem alimentar e em água, possuindo também elevada resistência antimicrobiana a antibióticos e desinfetantes o que tem conduzido, nos últimos anos, à necessidade de desenvolver novas técnicas e investigar novos compostos para o controlo e, em última instância, erradicação desta bactéria. O resveratrol, principal composto da família das fitoalexinas, possui inúmeras propriedades bioativas, nomeadamente a atividade antimicrobiana contra fungos e bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, tendo sido recentemente demonstrada a sua inibição sobre espécies de Arcobacter. De modo a fomentar a utilização deste composto em diversas aplicações, a sua baixa estabilidade e solubilidade aquosa têm vindo a ser ultrapassadas pela sua complexação e inclusão em diversos polímeros como, por exemplo, ciclodextrinas, sais biliares e microesferas poliméricas. De facto, a complexação do resveratrol com ciclodextrinas modificadas demonstrou um aumento considerável da solubilidade aquosa e da fotoestabilidade deste composto. Desta forma, o objetivo deste trabalho residiu no estudo da atividade antimicrobiana do resveratrol (RV), sob a forma de complexos de inclusão com a ciclodextrina modificada hidroxipropil-gama-ciclodextrina (HP-?-CD) contra uma estirpe de referência de A. butzleri (LMG 10828), dois isolados de origem animal (AB 17/11 e AB 36/11) e dois isolados de origem clínica (INSA 593 e INSA 776). Primeiramente procedeu-se à determinação dos fatores de virulência, onde os dois isolados clínicos revelaram a presença dos genes cadF, tlyA, cj1349, hecA, pldA, ciaB e mviN; a estirpe AB 36/11, apresentou mais um gene, o hecB, enquanto as estirpes LMG 10828 e AB 17/11 além dos oito genes descritos anteriormente, apresentaram no seu genoma o gene irgA. A resistência das estirpes a 9 antibióticos comuns foi também determinada, observando-se para a estirpe de referência e para os isolados clínicos a resistência à ampicilina, à amoxicilina, à vancomicina, à cefoperazona, à piperacilina e ao trimetoprim. Para além de apresentar resistência a estes antibióticos, a estirpe AB 36/11 tem resistência à ciprofloxacina. A estirpe AB 17/11 foi de todas elas, aquela que apresentou maior suscetibilidade, uma vez que o seu perfil de resistência inclui apenas os antibióticos vancomicina, ciprofloxacina e trimetoprim. A suscetibilidade do microrganismo aos complexos de inclusão (CI) formados foi determinada pelo método de microdiluição, onde se observou uma concentração mínima inibitória (CMI) de 256 µg/mL para as estirpes LMG 10828 e INSA 776 e 64 µg/mL para AB 36/11, AB 17/11 e INSA 593. Nesta fase foi também avaliada a suscetibilidade na presença de RV livre, obtendo-se uma CMI de 100 µg/mL para as cinco estirpes. De modo a determinar a ação bacteriostática ou bactericida dos CIs foram realizadas curvas de morte para um isolado clínico (INSA 776) e um de origem animal (AB 36/11), o que permitiu concluir que os CIs possuem atividade bactericida dependente tanto do tempo de incubação como da concentração de agente antimicrobiano. Para concentrações de CI correspondentes a 2x e 4x a CMI a viabilidade celular é semelhante para os dois isolados, sendo que o isolado de origem humana demonstrou ser mais suscetível. Para o RV livre, o efeito bactericida ocorre de forma mais rápida para 1x, 2x e 4xCMI em ambos os isolados. O mecanismo de ação dos CI foi avaliado por citometria de fluxo para estes dois isolados, usando os fluorocromos SYTO® 40 para marcação de todas as células, bis-(ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) trimetina oxonol (BOX) e 5-ciano-2,3-ditolil cloreto de tetrazólio (CTC), para avaliação de alterações a nível do potencial de membrana e atividade metabólica, respetivamente. Os resultados de citometria de fluxo demonstraram que, com o aumento da concentração de CI, ocorre a diminuição da atividade metabólica das células e, consequentemente, o aumento da despolarização da membrana das mesmas. Dado que a formação de biofilmes por parte dos microrganismos está associada com a sua virulência, colonização e resistência a antibióticos, torna-se importante a sua monitorização bem como o estudo de formas que inibam o seu desenvolvimento. Assim sendo, foi também evidenciada a ação dos CIs e do RV livre na formação e na promoção da dispersão de biofilmes pré-formados, com elevada redução de biomassa de biofilme para as concentrações de 1x, 2x e 4x a CMI. De forma geral, os resultados demonstram que os CIs apresentam atividade antimicrobiana sobre os isolados de A. butzleri tanto em células planctónicas como em biofilmes, sugerindo a aplicação destas formulações como soluções de origem natural para a indústria alimentar contra o desenvolvimento de Arcobacter spp.