Browsing by Author "Carvalho, Beatriz da Silva"
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- Development of ceramic nanoconjugates with plasmid DNA for the treatment of cervical cancerPublication . Carvalho, Beatriz da Silva; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Valente, Joana Filipa Abreu Pereira; Patrício, Tatiana Marisa FernandesO cancro do colo do útero afeta muitas mulheres em todo o mundo. Esta doença é principalmente transmitida por via sexual e é causada por uma infeção persistente de papilomavírus humano. O genoma do HPV codifica para várias oncoproteínas, nomeadamente para a E6. Após a infeção por este vírus a E6 liga-se à proteína supressora de tumores p53 e desregula o seu normal funcionamento levando à proliferação descontrolada e formação do tumor. O aumento da prevalência desta doença nos países em desenvolvimento é preocupante. As vacinas de DNA e a terapia génica têm sido estudadas para o tratamento do cancro induzido por este vírus. A terapia génica tem gerado particular interesse, tendo como objetivo transferir genes terapêuticos para células-alvo utilizando um vetor de DNA seguro, estável e eficaz. Os principais desafios associados a estas terapêuticas incluem a suscetibilidade do vetor de DNA à degradação durante a circulação no organismo do paciente, a necessidade de uma entrega direcionada, o processamento eficiente do sistema de entrega no interior da célula e a existência de barreiras intracelulares tais como a membrana celular. Para a tradução clínica da terapia génica, a formulação e a produção em larga escala de vetores de DNA, bem como a sua estabilidade e armazenamento, são importantes. As nanopartículas de fosfato de cálcio (CaP NPs) podem ser uma nova abordagem para a entrega de vetores de DNA na terapia génica, devido à sua elevada biocompatibilidade e biodegradabilidade, tendo sido utilizadas para a regeneração de tecidos, como os ossos e os dentes. Estes sistemas podem encapsular diversas biomoléculas, tais como ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, anticorpos ou fármacos. Além disso, as CaP NPs podem oferecer proteção contra a difusão imediata ou a degradação no ambiente circundante, permitindo a libertação controlada de fármacos e a terapia sustentada. Devido às suas características, CaP NPs constituem um vetor não viral promissor para a terapia génica direcionada ao cancro do colo do útero. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e caraterizar CaP NPs para a libertação de DNA plasmídico (pDNA) que codifica para a p53 em células de cancro do colo do útero. As CaP NPs foram sintetizadas utilizando um protocolo de biomineralização com citrato como agente estabilizador e regulador do crescimento de cristais de hidroxiapatite. Os sistemas foram totalmente caracterizados para determinar o seu tamanho, carga, composição química, eficiência de encapsulação e libertação de pDNA. Foram efetuados ensaios in vitro de internalização celular e de citotoxicidade, utilizando linhas celulares de adenocarcinoma cervical (HeLa) e de fibroblastos. Também foi desenvolvido um breve estudo preliminar sobre a funcionalização de CaP NPs com o ligando de biotina. Através de testes de caraterização, as CaP NPs obtiveram um tamanho de 76.34 ± 34.08 nm, com um índice de polidispersidade (PdI) de 0.40 ± 0.09 e uma carga superficial de – 20.90 ± 0.90 mV. Inicialmente, a inclusão do pDNA foi efetuada através de uma abordagem de adsorção, obtendo-se um tamanho de 133.13 ± 58.12 nm, um PdI de 0.65 ± 0.17 e uma carga superficial de – 23.70 ± 1.10 mV. Através da análise FTIR, é colocada a hipótese da presença de pDNA nas NPs de CaP/pDNA, devido à elevada intensidade e ao modo de vibração mais amplo em torno da zona de 1000 cm-1 , em comparação com o espetro das CaP NPs. Obteve-se também uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 100%. Foram executados estudos de transfecção, in vitro, em células HeLa e fibroblastos. Os estudos de viabilidade demonstraram a ausência de citotoxicidade das CaP NPs. No entanto, NPs com pDNA encapsulado em contacto com células têm um pouco efeito na sua citotoxicidade. Com base nestes resultados, foi necessário otimizar a quantidade de pDNA encapsulado. Neste sentido, foram desenvolvidos novos testes de caraterização e obteve-se valores de tamanho de 122.65 ± 8.41 nm, um PdI de 0.26 ± 0.01 e carga superficial de - 19.26 ± 0.80 mV com uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 88%. Foram efetuados novos testes in vitro, que mostraram um ligeiro aumento da citotoxicidade das CaP NPs carregadas com pDNA. A sua internalização foi verificada por microscopia confocal. Posteriormente, para funcionalizar estas nanopartículas, foi incluído na formulação um ligando, a biotina. A formulação obtida com biotina introduzida na solução de fosfato, resultou num tamanho de 221 ± 11.31 nm, um PdI de 0.23 ± 0.01 e uma carga superficial de - 13.79 ± 2.34 mV. Enquanto a formulação em que a biotina foi adsorvida, obteve um tamanho de 120.9 ± 10.75 nm, um PdI de 0.31 ± 0.05 e - 20.42 ± 1.59 mV de carga superficial. Análises FITR também foram realizadas, contudo não foram conclusivas para decidir qual a melhor formulação para a funcionalização de CaP NPs/pDNA com Biotina. Posteriormente, alguns estudos in vitro foram realizados para avaliar que método de funcionalização de NPs com biotina é mais adequado. A citotoxicidade em células cancerígenas aumentou significativamente quando a formulação obtida com biotina introduzida na solução de fosfato entregou o pDNA a células HeLa. A sua internalização foi também verificada através de microscopia confocal. Com base neste estudo, podemos concluir que as CaP NPs são veículos promissores para a entrega de pDNA que expressa o gene p53. No entanto, são ainda necessários mais estudos sobre a funcionalização com a biotina.