Browsing by Author "Chambel, Alexandra Prioste"
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- Células Natural Killer Endometriais: Uma Caraterização por Citometria de FluxoPublication . Chambel, Alexandra Prioste; Borrego, Luís Miguel Nabais; Barata, Luís Manuel Taborda; Martins, Catarina Gregório; Lima, JorgeAs células do sistema imune presentes no endométrio parecem desempenhar um papel importante no processo de implantação e manutenção da gravidez. Neste ambiente imune uterino, as células NK parecem ser a população linfocitária prevalente. Estas células NK uterinas distinguem-se das células NK que circulam na periferia pelo seu fenótipo caraterístico CD56bright, apresentando uma menor capacidade citotóxica, uma maior capacidade de produção de citocinas e a expressão de um conjunto de recetores com capacidade para reconhecer moléculas expressas pelas células do trofoblasto. Porém, mulheres que sofrem de perdas gestacionais recorrentes parecem ter diferentes perfis imunes locais. Existindo a necessidade de uma caraterização mais detalhada dos linfócitos presentes no endométrio, este estudo teve como objetivo primário a validação de uma estratégia detalhada de caracterização das populações de células NK e T em biópsias uterinas, através da análise multiparamétrica de imunofenotipagem por citometria de fluxo. Como objetivos secundários, pretendeu-se ainda estudar a possibilidade de implementar esta estratégia em mulheres com história de perdas gestacionais recorrentes de causa idiopática (PGRi) e identificar eventuais alterações no perfil imune, que se correlacionem com as diferentes características demográficas e obstétricas destas mulheres. Foram assim recrutadas mulheres com PGRi, nas quais foi efetuada uma biópsia endometrial com o sistema Pipelle®, entre os dias 7 e 10 após o pico de LH. Estas amostras foram depois divididas em replicados, processados em paralelo e analisados num citómetro de fluxo BD FACS Canto II. Para obter contagens absolutas de linfócitos endometriais foi utilizada uma estratégia de plataforma única com tubos BD TrucountTM e, para a caraterização das populações linfocitárias T e NK, foi de seguida utilizado um painel de anticorpos monoclonais, que incluía: CD3, CD8, CD16, CD45, CD56, CD57, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, 2B4 e PD-1. Os resultados obtidos no estudo da reprodutibilidade da estratégia de contagens absolutas com tubos BD TrucountTM demonstraram um coeficiente de variação médio de 7,61%. Estas amostras apontam para uma concentração de linfócitos uterinos entre 12,95 – 80,66 linfócitos/µL por centímetro de amostra em Pipelle. Através da análise imunofenotípica foram também identificadas as populações de linfócitos T, T CD8+, NK e NK CD56bright. A percentagem destas populações em relação ao total de linfócitos apresentou um coeficiente de variação médio abaixo dos 15% entre replicados. A análise mais detalhada das populações linfocitárias NK e T CD8+ permitiu identificar também boa reprodutibilidade (coeficientes de variação entre replicados inferiores a 14%) para a expressão de PD-1 e 2B4 em linfócitos T CD8+ e para a expressão de NKp46 e 2B4 em células NK. Por outro lado, a imunofenotipagem permitiu identificar que, no grupo de mulheres recrutadas, a população endometrial mais prevalente eram os linfócitos T (34,75 – 76,88%), e dentro destes os linfócitos T CD8+ (39,33 – 67,81%). Quando se consideram as subpopulações de células T separadas, no entanto, as células NK são o compartimento mais prevalente na maioria das amostras. Nos linfócitos T CD8 observaram-se níveis de expressão de 2B4 e PD-1 entre 78,20 – 97,00% e 49,75 – 89,35%, respetivamente. As células NK evidenciaram ainda níveis de expressão de NKp46 e 2B4 entre 31,60 – 69,65% e 95,90 – 99,95%, respetivamente. Foi ainda possível identificar uma correlação positiva entre a percentagem de células NK CD56bright NKp46+ e o número de partos de termo e gestações anteriores, uma associação que se pretende explorar em estudos futuros. Finalmente, verificou-se também uma correlação positiva entre a percentagem de linfócitos T CD4+ uterinos e o IMC das mulheres estudadas, uma observação que deverá igualmente considerar-se em estudos futuros, reconhecendo até as crescentes interações que têm vindo a ser descritas entre o estado nutricional e as respostas imunes e inflamatórias. A principal conclusão a retirar deste estudo é a aplicabilidade da citometria de fluxo na abordagem imunofenotípica de amostras endometriais. De facto, esta metodologia permite abordar com a reprodutibilidade necessária a quantificação celular, mas, sobretudo, permite uma caraterização multiparamétrica aprofundada dos perfis imunes uterinos. Esta técnica poderá assim assumir-se como uma ferramenta muito relevante a aplicar em contexto clínico no seguimento e tratamento de mulheres que sofrem de PGRi.