Percorrer por autor "Ferreira, Beatriz Morais"
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- Otimização do bioprocesso de obtenção da vacina de DNA minicircular contra o cancro do colo do úteroPublication . Ferreira, Beatriz Morais; Costa, Matilde Bogalheiro; Sousa, Ângela Maria Almeida deO cancro do colo do útero é um dos tumores mais prevalentes entre as mulheres a nível mundial, estando maioritariamente associado à infeção persistente pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV), sobretudo pelos genótipos de alto risco HPV-16 e HPV-18. Nestes casos, as oncoproteínas virais E6 e E7 desempenham um papel central na transformação maligna, ao promoverem a degradação das proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respetivamente. As vacinas de DNA têm emergido como uma estratégia promissora para a prevenção e tratamento de diversas doenças infeciosas e oncológicas. Esta abordagem baseia-se na introdução de DNA exógeno em células hospedeiras, com o objetivo de induzir a expressão de antigénios específicos capazes de desencadear uma resposta imunitária preventiva e terapêutica. Entre os vetores não virais utilizados, o DNA plasmídico (pDNA) tem sido o mais explorado, devido o seu baixo custo e facilidade de produção. No entanto, a presença de elementos bacterianos, como genes de resistência a antibióticos, pode desencadear respostas imunitárias indesejadas e reduzir a segurança da sua utilização. Como alternativa, o DNA minicircular (mcDNA) constitui uma geração mais avançada de vetores, resultante de uma recombinação intramolecular do plasmídeo parental (PP) numa cultura bacteriana, que se divide em duas moléculas filhas, o miniplasmídeo (mP) (constituído somente pelos genes procariotas necessários durante o processo de produção) e o mcDNA (sendo formado exclusivamente pela cassete de expressão eucariótica). Esta característica confere-lhe vantagens significativas face ao pDNA convencional, incluindo maior segurança, menor dimensão, eficiência acrescida de transfeção, maior estabilidade intracelular e expressão génica mais duradoura, traduzindo-se num elevado potencial terapêutico. Contudo, a sua aplicação clínica requer o desenvolvimento de métodos de produção e purificação robustos, capazes de cumprir os requisitos das entidades reguladoras. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo explorar a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) como estratégia para a purificação de pDNA e mcDNA. Numa primeira fase, foram estudadas as condições de separação entre pDNA e RNA, seguindo-se a avaliação da seletividade entre mcDNA e RNA. Observou-se que o mcDNA tende a eluir em fases mais precoces, o que pode estar associado à sua menor hidrofobicidade relativamente ao RNA. Os ensaios de quantificação permitiram avaliar a pureza e recuperação dos vetores de DNA em função das estratégias exploradas, verificando a sua conformidade com os parâmetros definidos pelas agências reguladoras para as condições otimizadas. Contudo, não foi possível obter uma separação clara entre isoformas de DNA nem entre mcDNA e PP. Em suma, os resultados demonstram que a HIC constitui uma abordagem promissora para a purificação de mcDNA, fornecendo uma base sólida para otimizações futuras e para a consolidação deste vetor como ferramenta terapêutica de nova geração.