Browsing by Author "Oliveira, Ana Sofia Domingos de"
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- Desenvolvimento e validação de um kit qPCR liofilizado para serotipagem de STEC para Aplicações de Segurança AlimentarPublication . Oliveira, Ana Sofia Domingos de; Carvalho, Josué Leandro de Oliveira e; Ferreira, Susana; Faria, MárciaO presente relatório de estágio descreve o decorrer do estágio integrado no 2º ano de mestrado em Bioquímica, na Universidade da Beira Interior. Este teve a duração de nove meses no departamento de Biologia Molecular da empresa ALS Life Sciences Portugal, S.A, sediada em Tondela. O principal objetivo do estágio consistiu no desenvolvimento de um método para a deteção dos genes de virulência (stx1, stx2, eae) e dos serogrupos e serótipos (O26, O45, O103, O104:H4, O111, O121, O145, O157:H7) de E. coli através da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real com base na ISO 13136 em processo de atualização, com o intuito de ser produzido um kit liofilizado. A PCR em tempo real foi escolhida como método de diagnóstico, por ser rápida e eficaz para impedir a disseminação das infeções provocadas por estirpes de E. coli, especificamente as Escherichia coli produtoras de toxinas Shiga (STEC). As STEC são bactérias Gram-negativas existentes predominantemente no sistema digestivo dos ruminantes e podem-se tornar bactérias patogénicas quando adquirem elementos de mobilidade como os bacteriófagos. As STEC podem ser transmitidas a humanos através do contacto direto com animais, ingestão de alimentos mal cozinhados ou não pasteurizados. A sua dispersão no trato gastrointestinal dos humanos provoca sintomas como vómitos, diarreia podendo agravar-se para o Síndrome hemolítico-urémico e/ou Colite hemorrágica. De modo a desenvolverem-se e implementarem-se quatro multiplex liofilizados (stx1+stx2+eae+IAC; O157+H7+O104+H4; O26+O45+O145; O103+O111+O121) para a deteção por PCR em tempo real, otimizaram-se as concentrações dos primers e sondas que constam na ISO 13136 em processo de atualização, verificaram-se as especificidades para microrganismos específicos, determinaram-se os limites de deteção das reações líquidas e liofilizadas com DNAs plasmídicos, as respetivas eficiências das reações e testaram-se os multiplex para a identificação dos microrganismos alvo em amostras reais e artificialmente contaminadas. Foi demonstrado que os primers e sondas usados para os diferentes multiplex eram específicos, os limites de deteção eram as 3 cópias dos DNAs plasmídicos por microlitro nas reações e as eficiências variaram entre 92% e 110%. Realça-se ainda que foi possível detetar os microrganismos em amostras reais e contaminadas artificialmente, demonstrando que o método desenvolvido pode avançar para os testes das reações de PCR multiplex em tempo real liofilizadas e posteriormente ser usado de forma comercial para a análise de diversos tipos de amostras.