Browsing by Author "Tente, Teresa Susana Ferreira"
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- Selecção de ligandos naturais para a purificação de DNA plasmídico por métodos de afinidadePublication . Tente, Teresa Susana Ferreira; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Marcos, João Carlos Ramos NunesNas últimas duas décadas, devido ao crescente interesse do uso de DNA plasmídico como vector não viral na terapia génica, bem como na produção de vacinas de DNA, aumentou significativamente a necessidade de produzir grandes quantidades de DNA plasmídico para fins terapêuticos. Reveste-se assim de grande importância a optimização dos processos de produção e purificação, tendo em vista a obtenção de grandes quantidades de um produto de elevado grau de pureza, com minimização dos custos de produção. Os métodos de separação e purificação baseados em interacções de afinidade são bastante promisssores, devido à sua elevada especificidade, no entanto, os custos elevados das macromoléculas utilizadas como ligandos, limita a sua aplicação potencial generalizada. Assim sendo, há a necessidade de usar outros ligandos mais baratos, surgindo como alternativa as pequenas moléculas que ligam ao DNA, destacando-se os antibióticos antitumorais e agentes anticarcinogénicos. A utilização destas pequenas moléculas como ligandos na purificação de afinidade de DNA plasmídico (pDNA), podem, num futuro próximo, ser implementadas como técnicas preferenciais na purificação de DNA com enorme potencial. O principal objectivo deste trabalho foi testar a possibilidade de utilizar, os antibióticos canamicina e berenil como ligandos de afinidade na purificação de plasmídeos. Foi realizado o estudo da interacção da canamicina e do berenil com um plasmideo modelo (pVAX1LacZ) através da titulação fluorimétrica do pDNA com brometo de etídio (BrEt) pelo método de Strothkam, na ausência e na presença de cada um dos ligandos. Foi também determinada a influência da concentração de cloreto de sódio (NaCl), nesta interacção Os dados foram analisados utilizando o gráfico e a equação de Scatchard tendo-se determinado para cada caso a constante de ligação. Ambos os fármacos estudados apresentam um comportamento competitivo em relação ao BrEt. O berenil parece ser um ligando de afinidade promisor para ser utilisado na purificaçõa de pDNA. De facto, para este ligando e para uma concentração de 1,0 M de cloreto se sódio registou-se uma elevada constante de ligação (12849,00 M-1) que diminui substancialmente para concentrações superiores ou inferiores deste sal. Estes resultados são importantes para uma possível utilização em cromatografia de afinidade, uma vez que sugerem um método simples para a ligação e eluição do plasmídeo de um suporte derivatizado com este ligando. Foi testada a utilização do berenil como ligando em cromatografia de afinidade. Contudo os ensaios preliminares, não foram muito conclusivos, uma vez que, o facto de não se ter conseguido reter o pDNA na coluna, pode ser devido à baixa densidade de ligandos imobilizados na coluna.