Departamento de Química
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Browsing Departamento de Química by Field of Science and Technology (FOS) "Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias"
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- Aplicação de Filmes de Óxido de Titânio na Degradação de CorantesPublication . Ferreira, Sílvio Alves Prata; Ciriaco, Maria de Lurdes FrancoNum mundo arrebatado pela crise económica global e em busca de uma solução para este problema crescente, muitas vezes ficam esquecidas temáticas de igual importância, como é o caso da Poluição, cuja minimização é fundamental para o equilíbrio do nosso ecossistema e o consequente bem-estar de todos os seres vivos. A poluição é um problema que afeta todo o globo na generalidade, sendo ela a principal responsável pela maioria das alterações no nosso ecossistema. Dentro desta problemática, enquadra-se a poluição aquática com especial enfase para a acumulação de poluentes persistentes neste meio. Este tipo de poluentes, onde estão enquadrados compostos como fármacos, aminas aromáticas ou corantes, entre outros, são muito prejudiciais para o ambiente, devido à sua difícil degradação/mineralização. Do ponto de vista económico, os processos de tratamento de efluentes mais vantajosos e também os mais utilizados são os processos biológicos, mas devido ao facto de muitos destes poluentes serem resistentes a este tipo de tratamento, os processos eletroquímicos têm vindo a ganhar terreno devido aos resultados promissores alcançados com estas técnicas. Neste trabalho foi abordada a degradação/mineralização de um “poluente modelo” o corante azo Acid Orange 7 (AO7) através da aplicação de uma técnica eletroquímica, a oxidação anódica, em que se utilizaram elétrodos de dióxido de titânio como ânodo, preparados por pulverização catódica DC, sobre substrato de titânio e substrato de titânio platinizado. Realizaram-se estudos de eletrodegradação do corante a diferentes densidades de corrente bem como a diferentes concentrações iniciais do poluente. Os ensaios realizaram-se numa célula eletroquímica que opera em modo “batch” com agitação, com um elétrodo dióxido de titânio como ânodo, um elétrodo de aço inoxidável como cátodo e um elétrodo de referência Ag/AgCl,KClsat, à temperatura ambiente e com o sulfato de sódio como eletrólito suporte. As amostras recolhidas durante os ensaios foram analisadas quanto à Carência Química de Oxigénio (CQO), ao teor de Carbono Orgânico Total (COT) e foi também efetuada a análise por espectrofotometria de Absorção UV-Visível. As melhores remoções de CQO obtidas variaram entre os 26% e os 56%, e as remoções de absorvência, medidas a 484 nm variaram entre os 11% e os 94%, para os ânodos de TiO2 não platinizado e o platinizado, respetivamente. Os valores de COT mantiveram-se praticamente inalterados durante os ensaios.
- Atividade antimicrobiana de barbituratos sobre Acinetobacter baumanniiPublication . Soares, Mafalda Neto; Domingues, Fernanda da Conceição; Ferreira, Susana Margarida ParaísoAtualmente tem-se vindo a assistir a um uso inadequado dos antibióticos, resultando num aumento de resistências bacterianas, sendo Acinetobacter baumannii uma dessas bactéria. Esta bactéria é ubíqua e é isolada com frequência de equipamentos e superfícies hospitalares, onde é motivo de preocupação. A. baumannii está associada a infeções como pneumonias, septicémias, infeções urinárias e infeções nosocomiais essencialmente do foro respiratório com particular incidência em doentes que necessitam de ventilação artificial. A. baumannii possui diversos fatores de virulência e patogenicidade, capacidade de manter a sua viabilidade por longos períodos de tempo o que permite que se mantenha em ambientes hospitalares devido à sua capacidade de formar biofilmes e resistir à dessecação. Para além disso é uma bactéria que frequentemente apresenta múltiplas resistências a antibióticos, tendo sido isoladas estirpes com resistências a todos os antibióticos conhecidos. Estas características de A. baumannii fazem com que esta bactéria se torne um alvo preferencial para estudo e desenvolvimento de novas terapias alternativas devido à problemática das resistências à maioria dos antibióticos atualmente comercializados. O ácido barbitúrico é um composto orgânico baseado no esqueleto heterocíclico da pirimidina, sendo considerado farmacologicamente inativo, ao passo que os seus derivados têm demonstrado possuir várias atividades biológicas, incluindo propriedades antibacterianas em algumas bactérias gram positivas e negativas. Os compostos de síntese derivados do ácido barbitúrico, nomeadamente compostos como 5-hidraziniletilidenopirimidinas, podem ser assim uma alternativa promissora aos antibióticos convencionas. Assim, este trabalho teve como objetivos avaliar a potencial atividade antimicrobiana de seis compostos 5-hidraziniletilidenopirimidinas, derivados do ácido barbitúrico, sobre A. baumannii, quer em células planctónicas quer em biofilmes, assim como estudar o mecanismo de ação e potencial atividade hemolítica destes compostos neste microrganismo. Os resultados sugerem que as estirpes estudadas são suscetíveis aos compostos derivados do ácido barbitúrico com valores de concentração mínima inibitória entre 2 e > 32 µg/mL, sendo que estes têm um efeito bacteriostático em A. baumannii. Para além disso, a combinação dos compostos com os antibióticos tetraciclina, eritromicina, cloranfenicol, ciprofloxacina e gentamicina pode promover uma redução na concentração mínima inibitória dos antibióticos. Também foi evidenciado que os compostos não clivam ao ADN bacteriano, não inibem as bombas de efluxo e não inibem o processo de quorum-sensing, no entanto diminuem a motilidade bacteriana e inibem a formação de biofilmes. Estes compostos não apresentam capacidade hemolítica, indicando que não são citotóxicos para os eritrócitos humanos. Assim, os compostos de síntese derivados do ácido barbitúrico mostraram potencialidades in vitro promissoras para o controlo de infeções, redução da resistência aos antibióticos e inibição da formação de biofilmes bacterianos, podendo ter por isso potencial uso como agentes terapêuticos contra este microrganismo, com a particularidade de não apresentarem citotoxicidade em eritrócitos humanos.
- Biodegradação anaeróbia de compostos derivados de Lignina e XenobióticosPublication . Daniel, Dalila Esteves; Gonçalves, Isolina Maria da Silva CabralOs resíduos gerados no setor agroindustrial apresentam um grande impacto ambiental, nomeadamente os de natureza lignocelulósica (carbohidratos complexos) e halogenada. Estes compostos originam produtos fenólicos tóxicos ameaçando o equilíbrio dos ecossistemas. A aplicação da digestão anaeróbia como processo biotecnológico de degradação de compostos fenólicos derivados de lignina, assim como de compostos de natureza halogenada, constitui um método alternativo particularmente atraente para o tratamento de efluentes agroindustriais, uma vez que assegura a redução da poluição garantindo, ao mesmo tempo, a conservação ambiental. No presente trabalho efetuou-se o estudo da biodegradação anaeróbia, em descontínuo, dos compostos fenólicos derivados de lignina, como a vanilina e a ortovanilina, assim como o 4-clorofenol, em regime mesófilo e termófilo, com o intuito de compreender os fatores que influenciam os sistemas biológicos de degradação destes compostos e assim viabilizar a sua aplicação futura no tratamento de efluentes e resíduos agroindustriais garantindo a sustentabilidade ambiental. Os resultados obtidos indicam que é possível seguir a degradação destes compostos por medição da absorvência a um determinado comprimento de onda. A adição de cosubstratos favorecem a degradação da ortovanilina, mas não afetam a degradação da vanilina. A vanilina é facilmente metabolizável pelas populações anaeróbias mistas, em particular em regime mesófilo, apresentando uma taxa de remoção de CQO de 75% ± 3 no final de 7 dias. A ortovanilina, apesar de apresentar uma bioeliminação mais favorável em regime mesófilo, tem taxas de remoção de CQO mais baixas (82% ao fim de 52 dias) do que as obtidas para a vanilina para igual tempo de reação. Os valores obtidos para os parâmetros cinéticos (k) de degradação da CQO e da diminuição da absorvência a 280 nm sugerem claramente uma velocidade mais elevada em regime mesófilo para os dois compostos. Os valores dos parâmetros cinéticos em regime mesófilo foram significativamente mais elevados para a vanilina (km = 0,214 d-1 e Kam = 0,016 d-1) do que para a ortovanilina (km = 0,028 d-1 e Kam = 0,036 d-1), corroborando o aumento da recalcitrância dos compostos por deslocação do grupo substituinte OH da posição para para a posição orto no anel aromático.
- Biosynthesis of a G-Quadruplex—forming sequence and its stabilization by ligandsPublication . Carvalho, Josué Leandro de Oliveira e; Cruz, Carla Patrícia Alves Freire Madeira; Cabrita, Eurico José da SilvaIn addition to the Watson and Crick B-form duplex DNA, G-quadruplexes are four-stranded DNA structures formed in vivo by the self-assembly of guanine-rich sequences. These can be formed by one, two or four separate strands of DNA and present a diversity of topologies, defined by the strand orientation, loop size and sequence. G-quadruplexes can be found in telomeres, immunoglobulin switch regions and gene promoter regions. The biological relevant location on the genome makes these high-order structures an attractive target for drug design and the development of highly specific ligands that bind and stabilize G-quadruplex with therapeutic activity. Herein, the biosynthesis of a novel G-rich quadruplex-forming DNA sequence 58Sγ3 is described by plasmid amplification. The recovery and purification of 58Sγ3 oligonucleotide using size-exclusion chromatography is presented. The G-quadruplex formation is promoted and its topology is determined by circular dichroism. The stabilization of the G-quadruplex structure with quinoline and naphthalene-based derivatives is studied using melting analysis, G4-FID and PCR-stop assays. The results suggest that 58Sγ3 folds into a parallel-stranded G-quadruplex structure in 500 mM KCl buffer and that naphthalene-based ligands bind and stabilize the G-quadruplex structure. The ligands are also found to be quadruplex-specific over duplex DNA and inhibit Taq DNA polymerase. This work provides evidence for G-quadruplex formation within the immunoglobulin switch regions. Furthermore, it is suggested that the novel ligands here reported act as potent specific G-quadruplex binders and may also potentially be used to inhibit genes transcription in tumor cells.
- Biosynthesis of therapeutic DNA plasmid using agri-food subproducts mediaPublication . Matos, Mafalda do Espírito Santo Silva; Passarinha, Luís António Paulino; Queiroz, João António de Sampaio RodriguesIncreased relevance of biomedical applications of plasmid DNA (pDNA) to induce therapeutic effects has having a great impact on industry and biopharmaceutical research. Gene therapy and DNA vaccines are a new approach for treating genetic diseases such as cancer. These new therapies are based on delivery systems of drugs based on nucleic acids that act at the level of the target cell, correcting or deleting the affected cells. Escherichia coli (E. coli) is the most used host system in the production of pDNA, due to their high growth in minimal media and its easy genetic manipulation. In this paper we used E. coli VH35, a variant with genetic modifications that minimize the accumulation of acetate. Several studies have been performed in different steps of production and purification of plasmid DNA into E. coli in order to increase the yield and productivity of this biomolecule. However, despite several optimization achieved, commercial substrates are used as culture media to produce this biomolecule, taking into account that the final yield of pDNA make the whole production process quite expensive. In order to overcome this problem, the commercial substrates may be supplemented or replaced by industrial wastes resulting in a pDNA yield very similar compared to commercial substrates, via a more economical process. In this paper we used the CSL ("corn step liquor") and the CWPS ("Cheese whey power solution") as alternative substrates in culture media for production of pDNA in E. coli.
- Caracterização fitoquímica e avaliação das propriedades antimicrobianas de cerejas do FundãoPublication . Catalão, Maria Beatriz Jerónimo; Duarte, Ana Paula Coelho; Ferreira, SusanaA crescente resistência antimicrobiana e a rejeição por parte da população de compostos químicos e sintéticos deu origem a uma procura de novos compostos. Estes deveriam ser de preferência naturais, cujas características organoléticas e químicas se juntassem a possíveis propriedades antimicrobianas para futuras aplicações na área alimentar e farmacêutica. Assim, surgiu uma nova área de interesse científico na procura de novos compostos com estas características em plantas e frutos. As cerejas são um fruto cujos componentes químicos parecem reunir todas estas características, nomeadamente os compostos fenólicos, os quais para além de serem fortes antioxidantes e portanto benéficos para a saúde, poderão ser considerados potenciais antimicrobianos. Assim, o objetivo principal desta dissertação passa pela obtenção, caracterização fitoquímica e avaliação biológica de extratos de seis variedades de cereja do Fundão, nomeadamente Brooks, Earlise, Primulat, Summit, Sweetheart e Saco (1ª Colheita e Colheita Tardia), totalizando sete amostras. Para a obtenção dos extratos ricos em compostos fenólicos foi utilizada uma extração convencional usando o metanol como solvente. A caracterização química foi realizada utilizando métodos colorimétricos – método de Folin-Ciocalteau para os fenóis totais, método colorimétrico em meio alcalino para os flavonóides totais, método de pH diferencial para as antocianinas e método do ácido dinitrosalicílico para os açúcares redutores, presentes nos extratos de cerejas. A avaliação biológica teve como base a determinação das atividades antioxidante e antimicrobiana. A atividade antioxidante foi avaliada pelo método colorimétrico de DPPH e a atividade antimicrobiana foi estimada através de metodologias que avaliaram a inibição de crescimento de vários tipos de microrganismos (bactérias Gram positivas e negativas e leveduras), a potenciação da atividade da tetraciclina, o papel das bombas de efluxo na resistência ao extrato de cereja e, também, a inibição de diversos mecanismos de virulência (quorum sensing, produção de piocianina e pioverdina, motilidade de tipo “swarming”, e formação de biofilmes). A caracterização dos compostos fitoquímicos presentes nas cerejas permitiu observar que as cerejas têm na sua composição um conteúdo em compostos que varia consoante a variedade de cereja. Quanto ao conteúdo de compostos fenólicos, a variedade de cereja Saco Colheita Tardia contém um maior teor de fenóis (274,52 mg GAE/100 g de cereja fresca) e a variedade Earlise tem um menor teor (54,87 mg GAE/100 g de cereja fresca. Para os flavónoides, também a Saco Colheita Tardia tem um teor mais elevado destes compostos (20,79 mg QE/100 g de cereja fresca), enquanto a Sweetheart é a variedade que tem menos flavonóides (6,00 mg QE/100 g de cereja fresca). Relativamente às antocianinas, mais uma vez a variedade Saco Colheita Tardia é a que tem um teor (73,05 mg Cy-3-glc/100 g de cereja fresca), destes compostos, mais elevado, sendo que a Earlise é a que tem o menor teor (9,14 mg Cy-3-glc/100 g de cereja fresca). Nestes compostos a variedade de Saco Colheita Tardia foi a que obteve os maiores valores. Nos açúcares redutores, a variedade de cereja Sweetheart é a variedade de cereja com mais açúcares (161,66 g/kg de cereja fresca), enquanto a Earlise é a que tem menos (78,907 g/kg de cereja fresca). Na avaliação da atividade biológica, os extratos de cereja apresentaram uma elevada atividade antioxidante com valores próximos do padrão Trolox, especialmente no caso da variedade Saco Colheita Tardia (EC50= 42,340 mg/L). Ao nível da atividade antimicrobiana, como os extratos de cereja contêm muitos compostos interferentes, mesmo utilizando um extrato enriquecido em compostos fenólicos, os resultados nesta área não foram muito satisfatórios, com o extrato de cereja conseguindo inibir o microrganismo K. pneumoniae e baixar a concentração mínima inibitória do antibiótico tetraciclina num efeito potenciador do antibiótico. No entanto, não se observou uma capacidade de inibição dos factores de virulência estudados. Assim, pode concluir-se que apesar de o extrato de cereja testado não apresentar atividade antimicrobiana significativa, os extratos de cereja testados apresentam um forte poder antioxidante, sendo esta a sua principal carateristica.
- Caracterização química das sementes de Foeniculum vulgare MillPublication . Mota, Ana Cláudia Spranger; Silva, Maria Lúcia Almeida daNos últimos anos tem vindo a aumentar o interesse pelos produtos naturais, como é o caso das plantas medicinais e aromáticas devido ao seu amplo espetro de ação na indústria alimentar, cosmética e farmacêutica e na medicina popular. Esta investigação consistiu na caracterização química das sementes do Foeniculum vulgare, vulgarmente conhecido como funcho, pertencente à família Apiaceae, sendo esta uma importante planta medicinal com atividade biológica comprovada. Para tal, procedeu-se a análise da composição química dos óleos essenciais das sementes de Foeniculum vulgare, colhidas em várias regiões de Portugal. Os óleos essenciais foram obtidos por hidrodestilação com Clevenger, com um rendimento entre 0.49 e 2.94%. Estes óleos essenciais foram posteriormente analisados por GC-MS, o que permitiu a identificação de dezassete compostos. Os constituintes maioritários dos óleos identificados foram o trans-anetol (7.9-78.5%), o estragol (1.8-66.0%) e a fenchona (12.0-37.0%). Realizou-se também a análise cromatográfica por HPLC – DAD dos extratos resultantes da extração com Soxhlet, com a finalidade de identificar e quantificar os compostos fenólicos presentes na planta. Foram identificados cinco compostos fenólicos, sendo eles o ácido gálico, ácido cumárico, ácido protocatecuico, ácido vanílico e a rutina.
- Carbocianinas em cromatografia de afinidadePublication . Paulo, Ivo Manuel Sobral Cordeiro; Boto, Renato Emanuel FelixDiferentes áreas da biologia dependem da cromatografia para obtenção de biomoléculas, sendo a cromatografia de afinidade o método de purificação mais seletivo para proteínas e outras biomoléculas. O desenvolvimento de novos suportes cromatográficos tem sido um tema investigado intensivamente no intuito de se encontrar um bom suporte, que reúna um equilíbrio ideal de características, tais como custos baixos, eficiência, elevada capacidade e estabilidade físico-química. Utilizando a esterificação de Steglich, que em anteriores trabalhos se tinha mostrado eficaz para a imobilização de ligandos a uma matriz de agarose, foram sintetizados vários suportes cromatográficos com dois ligandos e diferentes densidades de ligando. Como ligandos imobilizados foram utilizadas duas carbocianinas simétricas que diferem no número de anéis aromáticos da sua constituição. As carbocianinas simétricas são constituídas por dois anéis heterocíclicos iguais ligados por uma cadeia de três átomos de carbono com ligações duplas conjugadas. Posteriormente, foram estudadas as interações de afinidade entre os suportes cromatográficos obtidos e as várias proteínas modelo, dando preferência às interações iónicas e hidrofóbicas. Dentro de todos os resultados obtidos, o suporte com concentração inicial de 0,078mmol de ligando, apresentou picos mais bem definidos, tanto na separação da mistura proteica como nos testes com as proteínas isoladas, indicando ser o melhor suporte numa separação cromatográfica. Estes estudos permitiram demonstrar o potencial da aplicabilidade de ligandos catiónicos, tais como as carbocianinas, para a separação e purificação de proteínas por cromatografia de afinidade.
- A Contribuição de Bombas de Efluxo para a Resistência em Arcobacter butzleriPublication . Silva, Ana Luísa Cota Mateiro da; Ferreira, Susana Margarida Paraíso; Oleastro, Mónica Alexandra de SousaO género Arcobacter é constituído por 26 espécies reconhecidas até ao momento, de entre as quais Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas agentes patogénicos emergentes associados a enterites e bacteremias em humanos. A. butzleri é a espécie mais frequentemente encontrada em amostras humanas, ambientais e alimentares, pertencendo à lista de microrganismos considerados como perigosos para a saúde humana pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. Em paralelo, as elevadas taxas de resistência em A. butzleri têm vindo a aumentar, o que pode colocar em causa o tratamento de infeções graves ou mesmo levar a disseminação de resistência. Assim, considerando que a investigação em torno dos mecanismos de resistência desta bactéria é escassa, mas relevante, o objetivo deste trabalho passou pela avaliação do papel de bombas de efluxo na resistência a antimicrobianos por A. butzleri e estudo da relevância de um sistema de efluxo putativo da superfamília Resistance-Nodulation-cell-Division (RND). De forma a avaliar o papel do efluxo na resistência em A. butzleri, neste trabalho começou por se determinar o efeito de inibidores de bombas de efluxo (EPI) na resistência a antimicrobianos, através da determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de antibióticos, sais biliares e um desinfetante na ausência e presença de EPIs em cinco estirpes de A. butzleri. Seguidamente, através de análise in silico caracterizou-se a bomba de efluxo putativa do tipo CmeABC pertencente à superfamília RND. Por forma a compreender qual o seu papel na resistência de A. butzleri construiu-se um mutante por inativação do gene tipo cmeB da bomba de efluxo tipo CmeABC. Para a construção do mutante utilizou-se o método de transformação natural por mutagénese insercional, através de aplicação de DNA transformante contendo uma cassete de resistência à canamicina flanqueada por regiões integrantes do gene tipo cmeB da estirpe parental. Após a confirmação da mutação, comparou-se a influência da inativação do gene nas CMI a antimicrobianos das estirpes parentais e respetivas mutantes, bem como as alterações sofridas a nível de acumulação de brometo de etídio (EtBr). Com base nos resultados deste trabalho, pôde verificar-se que algumas das estirpes estudadas apresentaram um perfil de multirresistência, sendo que todas elas apresentavam resistência à cefotaxima. Por outro lado, nenhuma estirpe demonstrou resistência à gentamicina. A utilização de EPIs demonstra ter efeito, baixando os valores da CMI a alguns compostos. O PAßN, que é um inibidor de sistemas de efluxo do tipo RND, mostrou ser o inibidor globalmente mais eficaz. Estes resultados, sugerem que as bombas de efluxo RND terão um papel relevante na resistência de A. butzleri a antimicrobianos como a eritromicina, o Irgasan e em alguns casos a sais biliares. A análise in silico realçou a existência de uma bomba de efluxo putativa do tipo CmeABC em A. butzleri que apresenta uma identidade elevada com outros sistemas RND. Através da comparação entre a CMI das estirpes parentais e respetivas mutantes, verificou-se que efetivamente a bomba de efluxo tipo CmeABC tem um papel na resistência de A. butzleri à ciprofloxacina, ß-lactâmicos e eritromicina. Por sua vez, os ensaios de acumulação de EtBr confirmaram uma correlação entre a inativação do gene cmeB e o aumento da acumulação de EtBr, verificando-se que o gene cmeB, e por consequência a bomba de efluxo do tipo CmeABC, tem um papel no efluxo de compostos. Em suma, este trabalho demonstra o papel global das bombas de efluxo na resistência a antibióticos, sais biliares e desinfetante e a existência de uma bomba de efluxo tipo CmeABC funcional com papel na resistência de A. butzleri a alguns antimicrobianos.
- Desenvolvimento de criogéis funcionalizados com barbituratos para a purificação de uma vacina de DNA plasmídico contra o InfluenzaPublication . Martins, Andreia Segura Pinheiro; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraO vírus influenza é a causa de uma doença respiratória grave, comummente chamada de gripe, de elevada transmissibilidade e distribuição global e que provoca elevados níveis de mortalidade por todo o mundo. A melhor opção para travar esta doença viral e contagiosa é a vacinação. Apesar das vacinas da gripe convencionais, baseadas na tecnologia de ovos de galinha embrionados, serem normalmente eficazes, apenas conferem proteção contra as estirpes dominantes de cada ano e têm um risco zoonótico associado. Deste modo, são produzidas anualmente novas vacinas para antecipar as estirpes circulantes do vírus, processo que leva meses até estar concluído. As vacinas de DNA, baseadas na tecnologia do DNA recombinante, são uma alternativa promissora relativamente à vacinação convencional uma vez que são efetivas, e têm um processo de produção genérico e fácil de transpor para larga escala, em oposição ao complexo processo de produção associado às vacinas convencionais. Esta terapêutica consiste na expressão de um plasmídeo com os genes que codificam os antigénios de interesse num hospedeiro apropriado, permitindo a sua produção in vivo. No entanto, as vacinas de DNA requerem uma grande quantidade e com elevado grau de pureza, da isoforma superenrolada do DNA plasmídico biologicamente ativa. A cromatografia tem sido a técnica de escolha na purificação do pDNA por ser reprodutível, fiável e fácil de transpor para larga escala. No entanto, as matrizes convencionais usadas para este fim apresentam algumas limitações como as suas baixas propriedades de transferência de massa e baixa capacidade de ligação para moléculas maiores com o pDNA. Neste sentido, os criogéis podem ser utilizados no processo downstream por serem uma boa alternativa às matrizes cromatográficas convencionais, devido aos seus poros grandes e interconectados, boa difusibilidade e capacidade de ligação entre a molécula alvo e o suporte. O ácido barbitúrico, bem como os seus análogos tio- e/ou N,N-di-substituídos podem ser facilmente ligados aos criogéis ativados com grupos epóxido fazendo uso da bem descrita reatividade nucleofílica do C-5 na forma de enol ou enolato. Deste modo, foram preparados suportes cromatográficos baseados em criogéis derivatizados em condições acídicas e utilizando ligandos barbitúricos representativos como o ácido barbitúrico, tiobarbitúrico e 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico, com diferentes concentrações de ligando. Assim, no presente trabalho de investigação, foi testada a purificação do pDNA NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471 kbp que codifica a glicoproteína antigénica de superfície do vírus influenza, hemaglutinina, utilizando suportes de criogéis derivatizados com barbituratos. Para isto, foram quimicamente sintetizadas colunas de criogel com diferentes densidades de ligando. Inicialmente, foi estudado o perfil de retenção e eluição bem como a separação da isoforma superenrolada do pDNA da isoforma circular aberta, com base nas diferentes matrizes sintetizadas, sendo a coluna de criogel com ácido 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico com 5,0 mg/mL, aquela que demonstrou os melhores resultados, sendo por isso a escolhida para os estudos posteriores de separação de isoformas. Este suporte foi explorado através da manipulação de diferentes concentrações de sal e valores de pH, nos equipamentos cromatográficos Flash Protein Liquid Chromatographic e ÄKTA Purifier, numa tentativa de separar a isoforma superenrolada do pDNA como exigido pelas agências reguladoras. A melhor estratégia de separação das isoformas consistiu na aplicação de um gradiente crescente de cloreto de sódio usando 10,0 mM de tampão acetato de sódio com pH 5,0 como passo de ligação, e uma estratégia de eluição por dois passos usando o mesmo tampão com 0,550 M, seguido de 1,0 M de cloreto de sódio, que resultou numa separação parcial das isoformas sc e oc do pDNA do amostra pré-purificada. Na amostra de lisado, a utilização de 10,0 mM de tampão acetato de sódio com pH 5,0 como passo de ligação, e uma estratégia de eluição por dois passos usando o mesmo tampão com 0,263 M, seguido de 2,500 M de cloreto de sódio promoveu a separação da isoforma superenrolada do DNA do RNA, proteínas e outras impurezas com 65,60 % de pureza e um grau de recuperação de 88,0 %. Os resultados obtidos demonstram a aplicabilidade dos criogéis de ácido 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico com 5,0 mg/mL na separação e purificação das vacinas de pDNA contra o vírus influenza por cromatografia de afinidade.