Untitled

Funder

Organizational Unit

Publications

Natural compounds as new antibacterials to control Campylobacter spp

Publication . Duarte, Andreia Filipa Silvestre; Domingues, Fernanda da Conceição; Oleastro, Mónica Alexandra de Sousa

As doenças de origem alimentar continuam a ser um problema comum em todo o mundo. Ainda que possam ser provocadas por diversos agentes, são as bactérias, os vírus ou os parasitas a principal causa das infeções alimentares. O consumo ou processamento de alimentos contaminados têm sido descritos como as principais vias de transmissão para os humanos. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli têm sido descritos como a principal causa de gastroenterite bacteriana em seres humanos em todo o mundo e em 2013, na União Europeia, a campilobacteriose, infeção causada por Campylobacter, foi a zoonose mais relatada. Nos seres humanos, as espécies de Campylobacter têm sido associadas a uma variedade de condições gastrointestinais, tais como gastroenterite, doenças inflamatórias do intestino, cancro colon-rectal, síndrome do intestino irritável, entre outras e também podem provocar manifestações extra-gastrointestinais, como bacteremia, infeções pulmonares e abcessos. As complicações pós-infeção por este microrganismo incluem a artrite reativa e podem conduzir a doenças auto-imunes, tais como a síndrome de Guillain-Barré. A maioria das infeções por Campylobacter não necessita de intervenção terapêutica sendo apenas necessária reidratação. No entanto, em pacientes imunodeprimidos, pacientes cujos sintomas são severos ou persistentes e aqueles com infeções extra-intestinais é utilizado tratamento antimicrobiano, sendo os antibióticos mais utilizados a eritromicina e a ciprofloxacina. No entanto, em todo o Mundo tem-se verificado que as estirpes de Campylobacter são cada vez mais resistentes a antibióticos, incluindo os usados em humanos. Para além disso também têm sido descritas estirpes de Campylobacter resistentes a desinfetantes, o que se deve, principalmente, à sua capacidade de formar biofilmes. Estes biofilmes são um problema emergente na indústria alimentar, aumentando a possibilidade de contaminações ao longo da cadeia alimentar. Assim, e como os estudos relativos a Campylobacter são escassos, é da maior relevância estudar a epidemiologia de espécies de Campylobacter isoladas em Portugal, a sua resistência a antibióticos e procurar alternativas, aos antimicrobianos convencionais, para o seu controlo. Devido à escassez de estudos relativos à epidemiologia de Campylobacter em Portugal procedeu-se neste trabalho ao estudo da distribuição epidemiológica de isolados de Campylobacter de seres humanos, entre 2009 e 2012, em Portugal. Para isso, foram analisadas 837 estirpes obtidas através do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Destas 837 estirpes, 84,5% foram identificados como C. jejuni, 14,8% como C. coli, 0,2% como C. upsaliensis, 0,1% como C. concisus e 0,2% das amostras foram identificadas como Arcobacter butzleri. Em relação à sua distribuição por faixas etárias, observou-se que 61,5% das estirpes pertenciam ao grupo com idades entre 1 e 15 anos. Após este estudo preliminar, a partir deste grupo de isolados humanos, escolheram-se aleatoriamente 125 estirpes de Campylobacter (C. jejuni e C. coli) isoladas de seres humanos. A este grupo de estirpes, adicionaram-se 39 isolados de retalho alimentar e 32 de animais. As 196 amostras foram então caracterizadas através da tipagem por sequenciamento multilocus e da tipagem do gene flaA. Através destes métodos de tipagem, observou-se que as estirpes de C. coli eram geneticamente mais conservadas do que C. jejuni e que dentro de cada espécie, existiam isolados geneticamente relacionados provenientes de fontes diferentes. Em seguida, o fenótipo de resistência ao ácido nalidíxico, amoxicilina, ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina e tetraciclina foi avaliado pelo método de diluição em agar. Observaram-se elevadas taxas de resistência para todos os antibióticos com exceção à gentamicina, incluindo para os antibióticos utilizados no tratamento de campilobacteriose grave em humanos. Além disso, observou-se um fenótipo de resistência a múltiplos antibióticos (resistência a 3 ou mais classes de antibióticos) em 86% dos isolados. Perante os elevados níveis de resistência observados, estudaram-se os mecanismos moleculares subjacentes a essas resistências. Verificou-se que todos os isolados resistentes à ciprofloxacina possuíam a mutação Thr-Ile-86 na região que determina resistências às quinolonas no gene gyrA. Para a resistência à eritromicina apenas foi detetada a mutação A2075G no gene 23S rRNA. Em relação à resistência à gentamicina, observou-se que as três estirpes resistentes à gentamicina possuíam o marcador de resistência aos aminoglicosídeos aphA-3, sendo que uma das estirpes tinha uma mutação neste marcador. Foi ainda evidenciado neste estudo, que as bombas de efluxo cmeABC também podem desempenhar um papel na resistência a múltiplas drogas e no fenótipo da resistência a gentamicina. Assim, neste estudo foi possível obter uma visão geral da epidemiologia de Campylobacter em Portugal e descrever pela primeira vez a elevada taxa de multirresistência a antibióticos, assim como realçar o surgimento de estirpes de Campylobacter resistentes aos antibióticos de uso humano. Com base nos resultados deste estudo foram selecionadas estirpes com diferentes perfis genéticos e de resistência a antibióticos para serem utilizadas no decurso deste trabalho. Como o género Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana e a via alimentar é a principal via de contaminação, a elevada percentagem de estirpes resistentes a antibióticos aumenta o potencial zoonótico da infeção com estirpes multirresistentes. Logo, torna-se necessário controlar o crescimento de Campylobacter nas vias mais comuns de contaminação, que são os alimentos. Assim, o objetivo seguinte deste trabalho foi avaliar o potencial do resveratrol para controlar as estirpes de Campylobacter previamente caracterizadas. Apesar do resveratrol possuir várias propriedades biológicas, incluindo antimicrobianas, a sua baixa solubilidade em água e alta instabilidade comprometem a sua aplicação. Assim, para ultrapassar estes problemas, estudou-se o encapsulamento do resveratrol com metil-β-ciclodextrina. Verificou-se que a complexação do resveratrol com esta ciclodextrina provocou um aumento de 400 vezes na sua solubilidade. Em seguida o complexo de inclusão foi caracterizado através de Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Difração de Raios-X (XRD) e Microscopia Eletrónica de Varrimentos (SEM), confirmando-se efetivamente a sua formação. Seguidamente foram avaliadas algumas propriedades biológicas do resveratrol e do seu complexo de inclusão com metil-β-ciclodextrina, tendo-se verificado que ambos os compostos tinham atividade antioxidante muito forte, baixa toxicidade e ainda capacidade de reduzir a viabilidade das células Caco-2 (linha celular constituída por células epiteliais de adenocarcinoma colorectal heterogéneo). Além disso, também foi demonstrada a sua atividade antibacteriana contra estirpes de Campylobacter previamente selecionadas: duas estirpes de referência (C. jejuni ATCC 33560 e C. coli ATCC 33559), duas estirpes isoladas de fezes de pacientes com gastroenterite aguda (C. coli 53 e C. coli 873) e duas estirpes isoladas de carne de aves fresca (C. jejuni 225421 e C. coli 219872). Estes resultados sugerem que o resveratrol e o seu complexo de inclusão podem ser usados para controlar Campylobacter e que o resveratrol encapsulado em metil-β-ciclodextrina mantem as suas propriedades antioxidantes e antibacterianas. Uma vez que os resultados com o resveratrol e o complexo de inclusão foram bastante promissores, estudou-se ainda outro complexo de inclusão (resveratrol-hidroxipropil-γ-ciclodextrina), previamente formado e caraterizado pelo grupo de investigação, que revelou ainda ter um potencial antimicrobiano mais elevado contra Campylobacter e A. butzleri, um patogéneo de origem alimentar relacionado a Campylobacter. Dado isto, inicialmente avaliou-se a atividade antibacteriana em células planctónicas e mostrou-se que tanto o resveratrol como o complexo de inclusão têm um efeito bactericida contra as estirpes multirresistentes C. coli 873 e C. jejuni 225421. Com o objetivo de esclarecer o potencial mecanismo de ação do complexo de inclusão do resveratrol em hidroxipropil-γ-ciclodextrina sobre as estirpes de Campylobacter, começou por se avaliar a despolarização das membranas celulares e a atividade metabólica por citometria de fluxo. Através desta técnica, observou-se que complexo de inclusão pode atuar induzindo a despolarização da membrana e afetando a atividade metabólica das células. Dado que os biofilmes bacterianos são um problema emergente na indústria alimentar, também foi avaliado o potencial destes dois compostos para inibir a formação de biofilmes e eliminar biofilmes estabelecidos. Tanto o resveratrol como o complexo de inclusão foram capazes de inibir a formação de biofilmes e diminuir biofilmes previamente estabelecidos, mesmo em concentrações sub-inibitórias. O sistema quorum sensing (QS) tem sido associado à resistência antimicrobiana e formação de biofilmes, portanto, o potencial anti-QS destes dois compostos também foi estudado através da utilização de uma estirpe biossensor (Chromobacterium violaceum ATCC 12472). Verificou-se que ambos, o resveratrol e o complexo de inclusão, foram capazes de inibir o sistema QS, o que pode explicar o efeito anti-biofilme destes compostos. Assim, nestes estudos foram demonstradas as propriedades antimicrobianas e anti-biofilme do resveratrol e complexo de inclusão em estirpes de Campylobacter. Este aspeto associado ao facto de o resveratrol ser um composto de origem natural, e de também apresentar forte atividade antioxidante, encorajam futuros estudos com vista à sua aplicação como potencial conservante alimentar. Finalmente, uma vez que tem havido um interesse crescente na utilização de compostos naturais para aplicação em produtos alimentares, também foi avaliado o potencial do óleo essencial de coentros (Coriandrum sativum L.) e do seu principal composto, o linalool, para controlar Campylobacter. Ambos os compostos exibiram um efeito bactericida contra as quatro estirpes testadas (C. jejuni ATCC 33560, C. coli ATCC 33559, C. jejuni 225421 e C. coli 873) com valores de concentração mínima inibitória entre 0,5 e 1 μL/mL e observou-se que os compostos voláteis do óleo essencial de coentros também inibiram o crescimento de Campylobacter. Observou-se ainda que ambos os compostos inibiram a formação de biofilmes e promoveram a dispersão de biofilmes de Campylobacter. Como descrito anteriormente, também foi estudado o efeito destes compostos sobre o sistema QS. Foi demonstrada a atividade anti-QS do óleo essencial de coentros e do linalool através da inibição da produção de violaceína pela estirpe biossensor C. violaceum. Assim, mais uma vez, esta atividade anti-QS pode estar associada com a atividade anti-biofilme dos compostos, uma vez que o QS tem um papel importante na regulação da formação e desenvolvimento de biofilmes. Para além do potencial anti-bacteriano e anti-biofilme do óleo essencial e do linalool, também se avaliou a sua atividade antioxidante, uma vez que o processo de oxidação está relacionado com a perda da qualidade dos alimentos. Assim, observou-se que ambos os compostos têm uma elevada capacidade para inibir a peroxidação de lípidos. Em suma, os resultados demonstraram que estes compostos naturais podem ser utilizado para controlar Campylobacter e também como agentes antioxidantes para melhorar a qualidade dos alimentos. Em conclusão, neste trabalho, foram apresentados, dados recentes referentes à epidemiologia de Campylobacter em Portugal, bem como a sua diversidade genética e respetivos perfis de resistência a antibióticos. Diante disto, são necessários novos agentes antimicrobianos para controlar este patogéneo emergente de origem alimentar. Neste trabalho mostrou-se que o resveratrol e o óleo essencial de coentros, ambos compostos naturais, têm a capacidade de reduzir células planctónicas e biofilmes de Campylobacter, possuindo também várias atividades biológicas, incluindo propriedades antioxidantes. Este trabalho permitiu alargar o conhecimento sobre a epidemiologia e taxas resistência de estirpes de Campylobacter isoladas em Portugal e desenvolver novas estratégias de controlo deste microrganismo baseadas na utilização de compostos de origem natural.

2016-03Doctoral thesis

Open access