Browsing by Author "Martins, Andreia Segura Pinheiro"
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- Desenvolvimento de criogéis funcionalizados com barbituratos para a purificação de uma vacina de DNA plasmídico contra o InfluenzaPublication . Martins, Andreia Segura Pinheiro; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraO vírus influenza é a causa de uma doença respiratória grave, comummente chamada de gripe, de elevada transmissibilidade e distribuição global e que provoca elevados níveis de mortalidade por todo o mundo. A melhor opção para travar esta doença viral e contagiosa é a vacinação. Apesar das vacinas da gripe convencionais, baseadas na tecnologia de ovos de galinha embrionados, serem normalmente eficazes, apenas conferem proteção contra as estirpes dominantes de cada ano e têm um risco zoonótico associado. Deste modo, são produzidas anualmente novas vacinas para antecipar as estirpes circulantes do vírus, processo que leva meses até estar concluído. As vacinas de DNA, baseadas na tecnologia do DNA recombinante, são uma alternativa promissora relativamente à vacinação convencional uma vez que são efetivas, e têm um processo de produção genérico e fácil de transpor para larga escala, em oposição ao complexo processo de produção associado às vacinas convencionais. Esta terapêutica consiste na expressão de um plasmídeo com os genes que codificam os antigénios de interesse num hospedeiro apropriado, permitindo a sua produção in vivo. No entanto, as vacinas de DNA requerem uma grande quantidade e com elevado grau de pureza, da isoforma superenrolada do DNA plasmídico biologicamente ativa. A cromatografia tem sido a técnica de escolha na purificação do pDNA por ser reprodutível, fiável e fácil de transpor para larga escala. No entanto, as matrizes convencionais usadas para este fim apresentam algumas limitações como as suas baixas propriedades de transferência de massa e baixa capacidade de ligação para moléculas maiores com o pDNA. Neste sentido, os criogéis podem ser utilizados no processo downstream por serem uma boa alternativa às matrizes cromatográficas convencionais, devido aos seus poros grandes e interconectados, boa difusibilidade e capacidade de ligação entre a molécula alvo e o suporte. O ácido barbitúrico, bem como os seus análogos tio- e/ou N,N-di-substituídos podem ser facilmente ligados aos criogéis ativados com grupos epóxido fazendo uso da bem descrita reatividade nucleofílica do C-5 na forma de enol ou enolato. Deste modo, foram preparados suportes cromatográficos baseados em criogéis derivatizados em condições acídicas e utilizando ligandos barbitúricos representativos como o ácido barbitúrico, tiobarbitúrico e 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico, com diferentes concentrações de ligando. Assim, no presente trabalho de investigação, foi testada a purificação do pDNA NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471 kbp que codifica a glicoproteína antigénica de superfície do vírus influenza, hemaglutinina, utilizando suportes de criogéis derivatizados com barbituratos. Para isto, foram quimicamente sintetizadas colunas de criogel com diferentes densidades de ligando. Inicialmente, foi estudado o perfil de retenção e eluição bem como a separação da isoforma superenrolada do pDNA da isoforma circular aberta, com base nas diferentes matrizes sintetizadas, sendo a coluna de criogel com ácido 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico com 5,0 mg/mL, aquela que demonstrou os melhores resultados, sendo por isso a escolhida para os estudos posteriores de separação de isoformas. Este suporte foi explorado através da manipulação de diferentes concentrações de sal e valores de pH, nos equipamentos cromatográficos Flash Protein Liquid Chromatographic e ÄKTA Purifier, numa tentativa de separar a isoforma superenrolada do pDNA como exigido pelas agências reguladoras. A melhor estratégia de separação das isoformas consistiu na aplicação de um gradiente crescente de cloreto de sódio usando 10,0 mM de tampão acetato de sódio com pH 5,0 como passo de ligação, e uma estratégia de eluição por dois passos usando o mesmo tampão com 0,550 M, seguido de 1,0 M de cloreto de sódio, que resultou numa separação parcial das isoformas sc e oc do pDNA do amostra pré-purificada. Na amostra de lisado, a utilização de 10,0 mM de tampão acetato de sódio com pH 5,0 como passo de ligação, e uma estratégia de eluição por dois passos usando o mesmo tampão com 0,263 M, seguido de 2,500 M de cloreto de sódio promoveu a separação da isoforma superenrolada do DNA do RNA, proteínas e outras impurezas com 65,60 % de pureza e um grau de recuperação de 88,0 %. Os resultados obtidos demonstram a aplicabilidade dos criogéis de ácido 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico com 5,0 mg/mL na separação e purificação das vacinas de pDNA contra o vírus influenza por cromatografia de afinidade.