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Browsing by Author "Pinto, Joana Margarida Teixeira"

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  • Recuperação de microRNA através de Partículas Magnéticas
    Publication . Pinto, Joana Margarida Teixeira; Sousa, Fani Pereira de; Roque, Cecília
    O conceito de utilizar moléculas de RNA como agentes terapêuticos é relativamente novo, e a sua concretização requer a preparação de RNA em grande quantidade, mantendo a sua integridade, pureza e atividade biológica. Assim, torna-se cada vez mais imperativo o desenvolvimento de novas metodologias de recuperação do RNA cada vez mais eficientes, robustas e seletivas. Independentemente da origem do RNA, as fases de recuperação/isolamento e purificação desta biomolécula são de particular relevância e são cruciais para a obtenção de RNA biologicamente ativo e quimicamente estável. No presente trabalho, a bactéria Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 foi utilizada como hospedeiro recombinante para a produção de RNA, uma vez que apresenta várias vantagens, como a secreção diferencial de ácidos nucleicos durante o crescimento celular e a ausência de RNases. Para a recuperação do RNA presente no meio de cultura de R. sulfidophilum, mantendo a sua estabilidade, foi proposta uma estratégia baseada na utilização de nanopartículas magnéticas (MNP). Esta estratégia apresenta-se como mais vantajosa em relação a outras metodologias aplicadas, uma vez que com a secreção do RNA, o nível de contaminantes é inferior ao encontrado num extrato intracelular, o que facilita o processo de uma forma global. Por outro lado, a recuperação dos RNAs a partir do meio de fermentação poderá ser uma abordagem promissora, já que é evitada a utilização de sais e solventes orgânicos tipicamente necessários em processos convencionais de recuperação de RNA. No geral, é proposto o desenvolvimento de um método económico e rápido para a recuperação de moléculas de RNA funcionais com qualidade e atividade biológica. Neste âmbito, as MNPs foram usadas como meio de captura do RNA pois são fáceis de utilizar e permitem uma operação numa vasta gama de condições. As interações entre o RNA e as MNPs revestidas com o polímero dextrano foram as primeiras a serem investigadas, de maneira a saber em que condições as interações inespecíficas eram minimizadas, de forma a explorar a especificidade da interação do RNA com os ligandos usados na funcionalização das partículas. Verificou-se que com 1,5 M de sulfato de amónio a pHh 7,5 a percentagem de ligação era a mais baixa. Após este estudo inicial, as MNP foram funcionalizadas com diferentes aminoácidos ou derivados (arginina, agmatina, histidina, metionina e tirosina). Os resultados obtidos permitiram concluir que, o método utilizado para a funcionalização das MNP com os aminoácidos, deve ser otimizado, de modo a aumentar a densidade de ligando e, assim, aumentar a ligação do RNA às MNP. Como a estratégia de ligação com 1,5 M de sulfato de amónio em 10 mM de tampão Tris-HCl, a pH 7,5 e a variação da concentração das MNPs de 10 mg/mL para 30 mg/mL, não se traduziu num aumento significativo da ligação do RNA às MNP a estratégia foi alterada, sendo explorada a possibilidade de utilizar as MNPs revestidas para captura de RNA total ao invés de explorar a seletividade. Assim, as MNP revestidas com dextrano foram testadas relativamente à captura de RNA a partir de meios de fermentação de R. sulfidophilum suplementado com RNA, de maneira a avaliar o comportamento das MNP com os componentes do meio. Como a percentagem de ligação foi relativamente baixa e, sabendo que durante o processo de fermentação há consumo de nutrientes e libertação de metabolitos para o meio, a estratégia seguinte consistiu na avaliação do comportamento de ligação em amostras reais de fermentação. A primeira abordagem conduziu a uma captura de 10,6% de RNA, mas após otimização da força iónica do meio, a captura foi significativamente aumentada. Assim, ajustando a força iónica do meio para 1,5 M de sal foi recuperado 12,3% do RNA e um aumento da força iónica para 3 M conduziu a uma recuperação de 30,2%. Estes resultados são muito relevantes uma vez que, a suplementação do meio é um recurso viável tornando possível a captura de uma biomolécula com um crescente interesse por parte da indústria. De uma forma geral, este estudo preliminar permitiu concluir que com altas concentrações molares as percentagens de ligação são mais elevadas e que no futuro deve ser testado um novo método de funcionalização das MNP de maneira a aumentar a ligação e posteriormente, uma possível seletividade das MNPs para RNAs específicos.
    2017-11-3Master thesis Open access Show more