Percorrer por autor "Quelhas, Ana Rita Trindade"
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- Influência da tecnologia de purificação e estabilização na atividade biológica do microRNAPublication . Quelhas, Ana Rita Trindade; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Sousa, Fani Pereira deAté há pouco tempo, a molécula de RNA era ainda negligenciada em comparação com o DNA e proteínas, sendo descrito como um simples intermediário no fluxo da informação genética. No entanto, ao longo dos últimos anos o RNA tem sido associado a uma multiplicidade de processos biológicos, sendo hoje em dia, intitulado como um componente celular surpreendente. A investigação em torno da molécula de RNA tem levado a inúmeras descobertas biologicamente importantes e ao desenvolvimento ou aperfeiçoamento de novas abordagens terapêuticas. Um tipo de RNA que tem sido amplamente estudado, devido à potencial aplicação terapêutica, é o microRNA (miRNA). Este RNA pertence à classe dos RNAs de baixo peso molecular que regulam a expressão génica, e a sua desregulação tem sido associada a diversas patologias. Ainda assim, a necessidade de obter o RNA puro e intacto é extremamente relevante considerando esta vertente de aplicação clínica, e quer o seu isolamento quer a etapa de purificação e armazenamento apresentam-se como passos críticos devido à possível degradação do RNA, o que pode prejudicar a sua estabilidade estrutural e consequentemente a sua atividade biológica. Desta forma, torna-se fundamental garantir a estabilidade da molécula após todas as etapas do processo, visando a sua aplicação. Deste modo, o objetivo global deste estudo consiste no desenvolvimento e implementação de uma nova metodologia que permita manter a conformação nativa e atividade biológica do RNA, após todas as etapas críticas do seu processamento. Inicialmente foram realizados estudos cromatográficos baseados em cromatografia de afinidade com ligandos de aminoácidos, nomeadamente a matriz de L-metionina-agarose, para obter o pre-miR-29 com elevado grau de pureza. Como estes resultados não foram conclusivos, e não foi possível a separação eficiente do pre-miR-29, os estudos de estabilização foram realizados com RNA total. Assim, foram realizados ensaios de dicroísmo circular (DC) para avaliar a estabilidade estrutural do RNA, após o seu isolamento e incubação com diferentes classes de excipientes, nomeadamente sais (EDTA, citrato de sódio e acetato de sódio) e aminoácidos (histidina, prolina e arginina) nas concentrações de 1, 25 e 100 mM, e açúcares (sorbitol, trealose e sacarose) a 295 e 595 mM. O estudo de estabilidade inclui ainda a avaliação da estabilidade em função do tempo (7, 15 e 30 dias) e temperatura de armazenamento (4, -20 e -80ºC). De uma maneira geral, estes testes preliminares indicaram que o RNA na presença de EDTA ou arginina na concentração de 1 mM, conservados a 4ºC e -80ºC, mantém a sua estabilidade conformacional. Considerando os resultados obtidos, e para confirmar a ação estabilizadora dos aditivos na manutenção da atividade biológica do RNA foi usado como modelo o pre-miR-29. Estudos recentes apontam para uma alteração dos níveis deste miRNA na doença de Alzheimer (DA). Em condições fisiológicas, o pre-miR-29 pode atuar diretamente sobre a enzima ß-secretase 1 (BACE 1) responsável pela clivagem da proteína percursora amilóide (APP) e desta forma diminuir os depósitos extracelulares dos péptidos ß-amilóides (Aß). Estes estudos revelam a possibilidade da aplicação do pre-miR-29b como um alvo terapêutico, já que a reposição dos seus níveis nas células neuronais poderá induzir o silenciamento da BACE 1 e redução dos níveis dos péptidos Aß. Assim, no âmbito deste trabalho, o pre-miR-29 recombinante foi preparado e armazenado nas condições que apresentaram melhores resultados de estabilização, no dicroísmo circular, para posteriormente ser avaliada a sua atividade biológica, nomeadamente no que se refere à capacidade de reduzir os níveis de expressão da BACE 1. Após a produção do pre-miR-29, este foi purificado com a matriz de L-arginina-Sepharose, e foram realizados estudos de transfeção das células N2a695. Os resultados obtidos demonstraram que o pre-miR-29 incubado com arginina a -80ºC durante 30 dias apresenta uma diminuição da expressão do mRNA da proteína hBACE 1 de cerca de 90-100%, quando comparado com as outras condições de armazenamento testadas.