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- Physical and Chemical Parameters Screening for Co-Crystallization of rS -COMT-entacaponePublication . Fernandes, Pedro Daniel de Jesus Conde; Castro, Filipa Juliana Fernandes; Passarinha, Luís António PaulinoCatechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) is the enzyme responsible for the Omethylation of substrates such as catecholamines and estrogens with a typically catechollic structure. Commonly, COMT can be stabilized through specific molecules capable of increasing its thermodynamic stability, thus preventing its denaturation and loss of activity. After ensuring optimal conditions for protein activity, stability, and purity, carrying out structural studies is the next step. In these studies, crystallization tests are carried out with the aim of forming a crystal, in which the protein molecules are organized in a regular and orderly manner, to obtain information about their three-dimensional structure. In this work, we evaluated the effect of the interaction of ionic liquids on the enzymatic activity of SCOMT and investigated the crystallization conditions of purified SCOMT fractions. Firstly, we studied the influence of two ionic liquids, choline dihydrogen phosphate ([Ch][DHP]) and 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([C4mim]Cl), on the SCOMT lysate for 12 hours by applying a storage temperature of 4 ºC or -80 ºC and whether the ionic liquids would increase the stability of the protein, evaluating its specific activity. A greater potential stabilizing effect was obtained using [C4mim]Cl at 4 °C, with an activity recovery of about 350% over 12 hours. Then, crystallization tests of purified SCOMT fractions were carried out, using the vapor diffusion (Hanging Drop) and counter diffusion methods, where several factors were evaluated, namely, temperature (4 ºC and 20 ºC), concentration and composition of the precipitating agent solution (HEPES, pH=7.5, methyl-2,4-pentanediol and Caps, pH 10.5, Li2SO4, NaH2PO4/ K2HPO4) and the influence of S-adenosyl-L-methionine (SAM) and 3.5 -dinitrocatechol (DNC), a cofactor and a COMT inhibitor, respectively. By evaluating the various factors, we were able to conclude that better results were obtained at a temperature of 20 ºC, which corresponds to a precipitating agent solution composed of Caps, pH 10.5, Li2SO4, NaH2PO4/K2HPO4 and that the steam diffusion technique showed more promising results. In addition, a high concentration of precipitates was observed throughout the tests, mostly DNC and, in the minority, salts present in the solution of the precipitating agent. In a last step, the results obtained were classified, namely, distinguishing protein crystals from salt crystals, but due to their small size, X-ray identification was not possible. Thus, as an alternative, tests such as the absorption of dyes (Timol Blue and Coomassie Blue) were carried out and the Crush Test. These tests showed inconclusive results, since, due to the small size of the crystals, it was not possible to identify their nature with certainty.
- Aplicação de membranas para clarificação e/ou purificação de um vetor de DNA minicircularPublication . Carvalho, Daniela Maria Domingos de; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Valente, Joana Filipa Abreu Pereira; Alves, Nuno Manuel FernandesO cancro do colo do útero é um dos cancros mais prevalentes em mulheres em todo o mundo. Este tipo de cancro é causado pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV), nomeadamente pelos seus genótipos de alto risco mais virulentos, o HPV-16 e o HPV-18. Após uma infeção persistente, as oncoproteínas E6 e E7 expressas por esses vírus são responsáveis pela inibição e degradação das proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respetivamente. A terapia génica tem sido explorada nos últimos anos devido ao seu potencial no tratamento de doenças adquiridas e incuráveis. Esta abordagem terapêutica baseia-se na entrega de uma sequência específica de DNA exógeno a uma célula hospedeira, para alterar a função de uma determinada molécula que pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de uma doença. O DNA minicircular (mcDNA) tornouse um vetor de DNA não viral promissor, porque carece de sequências procarióticas consideradas prejudiciais (como genes de resistência a antibióticos, origem de replicação e motivos CpG, geralmente associados a questões de segurança) e, porque é um vetor de menor dimensão quando comparado com o DNA plasmídico convencional (pDNA), apresentando assim melhor eficiência de transfeção, permanência celular e expressão génica. Adicionalmente, os micro RNAs foram identificados como silenciadores de genes que degradam ou inativam um RNA mensageiro específico. Particularmente, foi comprovado que o micro-RNA-375 (miR-375) silencia a expressão das oncoproteínas E6 e E7 em células infetadas por HPV de alto risco. Assim, o presente trabalho visa a produção e purificação de um vetor de mcDNA que codifica o gene pri-miR-375, que futuramente poderá ser utilizado para terapia génica contra o cancro do colo do útero. No entanto, o processo biotecnológico para obtenção de mcDNA envolve várias etapas (nomeadamente centrifugações; concentração com solventes orgânicos; clarificação com altas concentrações de sal; métodos de purificação que consistem em cromatografia de exclusão molecular ou cromatografia de afinidade que são demorados ou não estão disponíveis comercialmente, respetivamente) que tornam o processo downstream bastante caro do ponto de vista da indústria farmacêutica, mostrando assim a necessidade do desenvolvimento de estratégias alternativas. Neste sentido, a presente dissertação sugere uma nova abordagem de recuperação do mcDNA, baseada no tratamento de lisado bruto com terra diatomácea para filtração direta e remoção de todos os detritos celulares e impurezas precipitadas, combinada com uma segunda etapa usando uma membrana cromatográfica Sartobindâ para purificar o DNA eliminando o RNA. Esta abordagem permite a substituição de várias etapas préestabelecidas para a preparação do lisado, nomeadamente a centrifugação dos restos celulares no final da lise alcalina, a etapa de concentração com isopropanol (e respetiva centrifugação) e a etapa de clarificação com sulfato de amónio (e respetiva centrifugação) poupando deste modo recursos, muito tempo ao processo global e, diminuindo o impacto ambiental. Na etapa de purificação, foi explorada a cromatografia de troca aniónica usando duas membranas, a Sartobind® Q75 e a Sartobind® D75. Após alguns estudos preliminares das condições de equilíbrio e eluição, foi otimizada a eliminação de grande quantidade de RNA diretamente no flowthrough, depois do carregamento da amostra de lisado simplificado, e o restante RNA foi eliminado durante um gradiente crescente de NaCl. A eficiência de ambas as etapas deste processo combinado foi comprovada através da quantificação das amostras recuperadas no final de cada etapa, usando uma coluna analítica CIMac™ pDNA e por fim a densidade de bandas do gel de agarose. No geral, os estudos realizados demonstraram a eficiência da estratégia combinada. Esta nova abordagem de preparação do lisado simplificada torna o processo mais rápido, passando a ser realizado em cerca de 40 min, enquanto que a abordagem convencional demora aproximadamente 180 min. Quanto à purificação do lisado, com a membrana Sartobind® Q75 foi possível obter uma recuperação quase total do DNA (» 100%), com uma pureza superior a 99%. No entanto, ainda é necessário realizar mais alguns estudos para melhorar o isolamento e o rendimento máximo do vetor mcDNA recuperado. Assim, espera-se que esta estratégia combinada possa ser ampliada e aplicada com sucesso na indústria farmacêutica para purificar vetores de DNA de forma rápida e económica.
- Feasibility Study on the Implementation of Safety Performance Indicators in an Airline Operator – Hi FlyPublication . Garcia, Danilo de Jesus Semedo; Saúde, José Manuel Mota Lourenço da; Sousa, Carlos Silvano deFollowing the changes that have been progressively introduced in the management of safety, in 2013 ICAO started to require all service providers to implement a Safety Management System structured in four components and twelve elements. The central part of this system is its performance management, which must be tracked through Safety Performance Indicators. Although the company, where this work took place (Hi Fly), has a system to track its safety performance, the dynamics of the civil aviation industry requires periodic updates at all levels, not only to cope with regulations but also to ensure constant improvement. In this context, this work was developed with the objective of studying the feasibility of creating a new system for the implementation and management of Safety Performance Indicators which, in line with the Hi Fly objectives, responds to the requirements set out in the aeronautical regulations. To this end, a bibliographic study of the framework and regulations surrounding the safety management system was carried out, in order to understand the role of the indicators in tracking safety performance, with a view to achieving safety objectives. Then, specific regulations for the creation, implementation and monitoring of safety performance indicators were analysed and compared with the safety performance management system already implemented in the organization to determine which aspects should be improved. This study resulted in the creation of a new process for the implementation of new indicators and an analysis tool was developed based on statistical methods to establish triggers for each indicator. Additionally, this tool has the capacity to store and sample data related to safety performance indicators. The results obtained were validated and approved by the Safety Manager of the company, after several simulations were performed using real data previously obtained.