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- Efeito anti tumoral dos canabinóides em glioblastoma: modulação pela adenosinaPublication . Guerreiro, Virgínia Juliana Pereira; Lopes, Helena Tomás Marcelino; Cascalheira, José Francisco da SilvaDentro do grupo dos gliomas, o glioblastoma (GB) é considerado o mais maligno. Este tumor é classificado como um astrocitoma de grau 4 e é caracterizado pela elevada proliferação celular e intensa angiogénese. Devido à sua significativa heterogeneidade, bem como à barreira hematoencefálica exclusiva do sistema nervoso central e ao microambiente imunossupressor, as terapias convencionais não têm demonstrado eficácia satisfatória no tratamento do GB. Diante da escassez de alternativas terapêuticas eficazes, surge uma necessidade urgente de desenvolver abordagens inovadoras que considerem as características peculiares do GB. Os derivados da Cannabis sativa L. despertaram crescente interesse como potenciais agentes terapêuticos para o GB, atribuídos às suas variadas propriedades: psicotrópicas, analgésicas, anticancerígenas, anti-inflamatórias, anticonvulsivas, antibacterianas e antifúngicas. Os canabinóides atuam nas células de GB via recetores dos canabinóides (recetor tipo 1 e recetor tipo 2), através de três mecanismos principais: indução da morte celular, inibição da divisão celular e ações antiangiogénicas. Em condições de hipoxia associadas ao GB, há um aumento da concentração de nucleótidos e nucleósidos extracelulares, como a adenosina (Ado). Este aumento de Ado está associado à superexpressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que favorece a angiogénese e o crescimento tumoral. No entanto, de acordo com o trabalho prévio do nosso grupo, a inibição da adenosina cinase (ADK) pelo ABT-702 diminui a proliferação celular do GB, sugerindo que a regulação das concentrações de Ado pode ter um papel crucial na dinâmica tumoral. Embora ainda não se conheça a interação entre os inibidores da ADK e canabinóides, a possibilidade de que os canabinóides possam potencializar os efeitos da inibição da ADK representa uma área promissora para futuras investigações. Assim, os canabinóides apresentam-se como potenciais agentes terapêuticos para o GB, uma vez que interferem em processos celulares fundamentais, reduzindo a proliferação e divisão celular, bem como a angiogénese, essenciais para o suprimento de nutrientes às células tumorais. O objetivo desta dissertação foi investigar de que forma os canabinóides afetaram a proliferação e a apoptose em linhas celulares de GB, com especial atenção para a modulação mediada pela Ado e para a interação com fármacos que inibem o seu metabolismo. Foram avaliados os efeitos na presença como na ausência de inibidores dos recetores de Ado. Para tal, foram realizados ensaios de MTT a fim de avaliar a proliferação/viabilidade celular, utilizando linhas celulares de GB (U87 e U373) que foram incubadas por 72 horas com o canabinóide sintético WIN (5µM). Este tratamento foi realizado na presença ou ausência do inibidor da ADK, o ABT-702 (30µM) e também na presença ou ausência de um cocktail de antagonistas dos recetores de Ado, para distinguir entre efeitos mediados e não mediados pelos recetores da Ado. Em ambas as linhas celulares de GB, a combinação de WIN com ABT-702 resultou numa redução significativa da viabilidade celular, embora a presença de altas concentrações de Ado intracelular tenha atenuado ligeiramente o efeito do WIN. Quanto à combinação de cocktail de antagonistas dos recetores de Ado e WIN, o bloqueio dos recetores de Ado pelo cocktail de antagonistas permitiu que o WIN apresentasse um efeito antitumoral mais acentuado, implicando efeito protetor da Ado extracelular não é mediado através destes recetores, contrastando com o efeito anti proliferativo da Ado intracelular. Nos ensaios de migração celular, o WIN (5µM) reduziu a migração celular nas linhas celulares U87 e U373, bem como nos astrócitos primários humanos. A combinação de WIN com ABT-702, resultou numa ligeira atenuação do efeito do WIN. Na linha celular SNB19, os resultados sugerem uma ligeira redução na migração celular com o WIN, embora sem significado estatístico. Relativamente aos ensaios de imunocitoquímica, não foi possível demonstrar que o WIN (5µM) induza apoptose na linha celular U373, sugerindo um efeito essencialmente citoestático do WIN. Em síntese, o WIN provocou uma diminuição significativa na viabilidade celular nas linhas U87 e U373, reduzindo também a migração celular nas linhas U87 e U373, bem como nos astrócitos humanos, corroborando o seu efeito antitumoral. Contudo, os resultados indicaram que a inibição da ADK pelo ABT-702 atenuou o efeito do WIN, sugerindo que a interação entre o ABT-702 e o WIN é menos que aditiva, devido ao aumento da Ado intracelular.
- Development of co-delivery nanoparticles of temozolomide and plasmid DNA for glioblastoma treatmentPublication . Afonso, Inês Sofia Patricio; Costa, Diana Rita Barata; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Santos, Adriana Oliveira dosGene therapy is a promising and innovative strategy for cancer treatment, particularly for glioblastoma, an aggressive and highly lethal form of brain cancer with limited therapeutic options and a poor prognosis. Combining gene therapy with chemotherapy has the potential to amplify therapeutic effects through their synergistic interaction, offering a more effective approach to overcoming tumor resistance and improving patient outcomes. This study focused on the development of a co-delivery system based on BSA-coated TMZ-WRAP5/p53 nanocomplexes targeting glioblastoma cells. Temozolomide, a standard chemotherapeutic agent for glioblastoma, was associated with a plasmid encoding the p53 tumor suppressor gene. BSA coating was used to increase the stability, biocompatibility and delivery efficiency of the complexes. An Experimental Design tool was used to optimize the formulation of this complex, including the N/P ratio, BSA concentration and addition time. The optimization process involved evaluating key properties such as particle size, surface charge and DNA complexation capacity. It was determined that the ideal formulation had an (N/P) ratio of 1.03 and a BSA concentration of 0.08%, resulting in complexes of approximately 182 nm, a zeta potential of +9.8 mV and a DNA complexation efficiency of 96.5%. These BSAcoated spherical complexes showed high stability and biocompatibility. In vitro biocompatibility and cytotoxicity studies using MTT showed a substantial reduction in the viability of glioblastoma cells, without toxicity to astrocytes. The results of PCR and qPCR assays showed a significant increase in p53 levels in glioblastoma cells treated with the BSA-coated complex. These data show that this delivery system has significant potential to overcome the challenges associated with conventional glioblastoma therapies.