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- Aplicação de antibióticos como ligandos em cromatografia de afinidade para purificação de DNA plasmídicoPublication . Nunes, Catarina Caramelo; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Marcos, João Carlos Ramos NunesAs Terapias Moleculares, como a Terapia Génica e as Vacinas de DNA, estão a criar um aumento da procura de grandes quantidades de DNA plasmídico (pDNA) puro. Apesar de já estarem disponíveis vários métodos, baseados em protocolos da biologia molecular, para a purificação de plasmídeos, a grande maioria não são apropriados para o uso em larga escala. Para além disso, esses protocolos usam com frequência reagentes tóxicos, os quais impedem a sua utilização para a purificação de produtos terapêuticos. Já os métodos baseados na afinidade usados até agora, parecem ser bastante promissores, contudo a maior parte faz uso de macrobiomoléculas de preços elevados, que impedem a sua utilização extensiva. Sabe-se que são várias as moléculas que ligam ao DNA com uma especificidade elevada, como certos antibióticos e agentes anticancerigenos. É o caso das moléculas focadas neste estudo: a neomicina e a berberina. Desta forma, estes ligandos representam uma boa alternativa para a aplicação a protocolos de purificação por afinidade. Tendo esse objectivo em mente, as afinidades de ligação entre as moléculas acima mencionadas e um pDNA modelo (pVax1LacZ), foram avaliadas, recorrendo à técnica de titulação fluorimétrica desenvolvida por Strothkamp. A titulação do pDNA com brometo de etídio (BrEt) foi seguida através da intensidade de fluorescência, na ausência e presença de diferentes concentrações dos ligandos em estudo. Aos dados obtidos foi aplicado o método de Scatchard, para assim se determinar o efeito de cada um dos compostos na ligação do BrEt ao pDNA. As constantes de ligação de cada composto foram depois calculadas para diferentes concentrações de cloreto de sódio. Os resultados obtidos mostram que o antibiótico que apresenta a constante de afinidade mais elevada é a berberina, a uma concentração de cloreto de sódio 1,0 M, podendo assim ser um ligando promissor para a purificação de pDNA por afinidade. O suporte escolhido para os ensaios de cromatografia de afinidade foi o Epóxi – (CH2)4 – Sepharose™, contudo a berberina não contém grupos hidroxílicos funcionais para poder ser directamente imobilizada. Desta forma, foram realizados estudos visando a clivagem do seu grupo metilenodióxido para a obtenção de um catecol, alcançando-se os melhores resultados através do uso de tricloreto de alumínio, como activador. Porém, em vez de um único composto, foi obtida uma mistura de quatro produtos, derivados da hidrólise dos grupos metóxido. Ainda assim, procedeu-se à imobilização da mistura ao suporte e analisou-se a interacção do gel obtido com o pDNA. Estudou-se também a influência da concentração de sal no perfil cromatográfico. Os resultados obtidos mostram que, para todas as concentrações de sal, a amostra foi imediatamente eluída após a injecção, sem qualquer retenção na coluna. Este pode ter sido consequência de uma possível baixa densidade de ligandos na coluna ou ao facto da constante de afinidade calculada não representar a verdadeira afinidade existente entre a berberina e o pDNA. O facto de a derivatização ter sido realizada com quatro compostos diferentes, pode também ter sido responsável pela má retenção. Uma vez que esta foi a primeira vez que um antibiótico foi usado como ligando para a purificação de pDNA, criou-se um campo de investigação promissor e pouco explorado, que poderá melhorar e simplificar os protocolos já existentes, para além de, num futuro próximo, poder ser usado para implementar esta abordagem cromatográfica à purificação, em larga escala, de vectores plasmídicos para serem usados nas terapias moleculares.
- Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small aromatic moleculesPublication . Nunes, Catarina Caramelo; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Marcos, João Carlos Ramos NunesMolecular therapies are gaining importance as an effective therapeutic approach for various types of diseases. The most efficient vectors used to introduce the therapeutic genes are of viral origin however, non-viral vectors based on pDNA are gaining popularity due to their superior safety and easy of production. These factors have increased the demand for high quantities of pharmaceutical grade plasmid DNA (pDNA). Therefore, the research for more efficient pDNA purification protocols has also increased. Moreover, the final pDNA product must meet stringent quality criteria established by the regulatory agencies. Liquid chromatography is the method of choice for the purification of pDNA, since it is simple, robust, versatile and high reproducible. The most important features of a chromatographic procedure are the use of suitable stationary phases and ligands. As conventional purification protocols are being replaced by more sophisticated and selective procedures, the focus changes towards designing and selecting ligands of high affinity and specificity. In fact, the chemical composition of the chromatographic supports determines the interactions established with the target molecules, allowing their preferential retention over the undesirable ones. With these facts in mind, the aim of this work was to develop new chromatographic methods for the purification of pharmaceutical grade pDNA, with the purpose of improving the overall procedures to more effective, simple, economic and environmental-friendly ones. The minor groove binder berenil and the intercalator 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP) where chosen to be used as ligands in pDNA chromatographic purification studies. They were immobilized to an epoxy-activated Sepharose matrix using a relatively mild curing method, without a catalyst and with quite small ligand:Sepharose weight ratios. Berenil binds pDNA preferentially through hydrophobic interactions but other types of interaction contributions cannot be neglected. It was shown to be quite effective at separating and purifying pDNA from clarified and non-clarified cell lysates, using three different approaches, although isoform resolution was not obtained in either case. Using mild amounts of ammonium sulphate in the eluent, berenil-Sepharose support was able to purify distinct pDNA of two different sizes from clarified cell lysates. Moreover, the ability was continual when the clarification process was replaced by a second chromatographic run. In all cases plasmid solutions were in accordance to the specifications of a pharmaceutical product, however the yields were quite different: two consecutive chromatographic runs lead to lower recoveries (33%) and smaller pDNA molecules have higher recoveries using one run through the column (85% vs 45%). A negative chromatography approach was also performed with berenil-Sepharose, showing some advantages in terms of salt usage as well as procedure time. In this case the recovery yield was quite good (87%) and although pDNA solutions had a comparable purity to that obtained with the other approaches, the gDNA reduction was not so effective. DAPP is slightly A-T specific and binds DNA through non-covalent, reversible stacking interactions of the condensed aromatic moiety into two successive base pairs, while the phenyl residue gets inserted into the minor groove. In addition, protonated DAPP molecules bind to DNA much strongly due to the generation of strong electrostatic interactions. Plasmid DNA binding to DAPP-Sepharose varies with pH and is affected by the presence of salt in the eluent. In fact, total retention of clarified lysate components was only possible with a pH below DAPP's free state pKa (5.8) and the presence of salt destabilizes that same retention. So, the elution of bound species was simply performed by adding small amounts of sodium chloride to the buffers. These features were successfully applied for purification of sc pDNA with two distinct sizes that were obtained according to the regulatory agencies specifications. Once more, the recovery yield of the smaller pDNA molecule was higher than the one obtained for the largest one (94% vs 65%). In conclusion, DAPP-Sepharose showed exceptional characteristics to be used as an affinity support for the purification of pharmaceutical grade sc pDNA. In comparison with berenil- Sepharose, it uses much smaller amounts of salt, with less economic and environmental impact, while improving the quality and yield of the obtained plasmid fractions. Moreover, it is able to separate sc pDNA from linear and oc isoforms even in complex lysates. Moreover, combining DAPP-Sepharose chromatography with other optimized production, extraction and clarification procedures, can offer a number of advantages for pharmaceutical pDNA purification. Also, since the most significant disadvantage of this DAPP-Sepharose support is the relatively low capacity for pDNA, which in turn is strongly related to the solid matrix used, other more stable stationary phases with low pressure drops and interconnected macropores, that allow a high mass transfer of solutes, are quite fascinating alternatives.