Laboratory of Separation and Reaction Engineering - Laboratory of Catalysis and Materials

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Purification of pre-miRNA-29 with ionic liquids-based supports

Publication . Nunes, Sérgio Almeida; Sousa, Fani Pereira de; Bernardo, Sandra

MicroRNAs (miRNAs) have been studied regarding their biological role in gene expression regulation at post-transcriptional level, envisioning the establishment of new treatment strategies. Pre-miRNA-29 is the precursor form of microRNA-29, a small noncoding RNA that plays an important role in gene silencing, and proved to be involved in several cellular mechanisms, namely in neurodegenerative diseases. To consider the therapeutic application, efficient, and economically feasible manufacturing processes are required for obtaining these biopharmaceuticals, assuring their integrity, purity, stability, and bioactivity. Thus, in this work it is proposed an alternative purification method using Ionic Liquids (ILs)-based chromatographic supports. ILs are described as ionic compounds that present a melting point below 100 °C and are normally composed of large and asymmetric organic cations and organic or inorganic anions. These types of compounds can be tailored in terms of their properties, such as polarity, density, and viscosity to achieve their effectiveness regarding the purification and stabilization of nucleic acids. The application of Supported ILs (SILs) in RNA purification is highly innovative and can lead to the establishment of advantageous purification methods. Herein, the SIL under study resulted from the functionalization of silica with the 1-(3- aminopropyl)imidazole chloride, which was named as SilPrImPrACl. First, a screening of the best experimental conditions, in terms of pH and ionic strength, to promote binding and elution of RNA was carried out. Moreover, in order to develop an Experimental Design, key factors were optimized at 3 levels, using the Central Composite Design (CCD) as model. The statistical analysis of the results showed that this model was not the best fit for the optimization of the purification of pre-miRNA-29b, however further analysis was carried out in order to understand the influence of the factors studied in the recovery, purification factor and removal of impurities. Thus, it was possible to establish some conditions conducting to a recovery and purification factor of 35.1% and 1.55, respectively. Furthermore, it was verified that the process was able to remove 78% of proteins and 70% of gDNA present in the initial sample, proving the effectiveness of this SIL for the purification of RNA and particularly the pre-miRNA-29b.

2023-01-20Master thesis

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Carbon Nanotubes in RNA capture – characterization and application in biotechnological processes

Publication . Videira, Ana Margarida Ferreira; Sousa, Fani Pereira de; Silva, Cláudia Gomes

Nos últimos anos, a investigação tem conduzido a progressos notáveis no desenvolvimento de terapias baseadas em ácidos nucleicos. Apesar destas abordagens terem como ponto de partida o DNA, investigações recentes têm avaliado o potencial terapêutico do RNA. A compreensão das funções do RNA e do seu papel preponderante em várias doenças, destacou o seu potencial de aplicação como biomolécula terapêutica. Neste contexto, o recente desenvolvimento de vacinas eficazes baseadas em mRNA em resposta à pandemia da COVID-19 despertou ainda mais o interesse da investigação em terapias baseadas em RNA. No entanto, os processos efetivos de produção ainda enfrentam inúmeros desafios. Um dos processos mais cruciais é a recuperação e purificação do RNA, uma vez que associado ao processo de produção várias biomoléculas consideradas impurezas estão presentes, e são difíceis de eliminar pois partilham várias características com o RNA. Além disso, a presença destas impurezas no produto final pode representar problemas de imunogenicidade quando se considera a etapa final de entrega e administração terapêutica, tornando o seu processo de remoção obrigatório. Contudo, os métodos atualmente disponíveis e utilizados para o isolamento de RNA são limitados, demorados, pouco eficientes e muitas vezes requerem o uso de reagentes tóxicos, o que, para além de causar um enorme impacto a nível ambiental, pode comprometer a pureza, integridade e atividade biológica do RNA, parâmetros considerados imprescindíveis na recuperação do produto a ser aplicado biologicamente. Para responder a este problema, a utilização de materiais à base de carbono como candidatos a adsorventes para a captura de ácidos nucleicos surge como uma opção muito promissora devido às suas excelentes propriedades mecânicas, químicas e térmicas. Dentro destes materiais de carbono, os nanotubos de carbono (CNTs), destacam-se consideravelmente devido principalmente à excelente capacidade de adsorção de várias biomoléculas, o que tem potenciado a sua aplicação em diversas aplicações biológicas. Adicionalmente, os CNTs já demonstraram ser capazes de adsorver RNA. Porém, a forte interação CNT-RNA torna a dessorção de RNA um passo bastante crítico. Deste modo, neste estudo, é descrito um método eficaz, simples e economicamente mais rentável para a captura e recuperação de RNA a partir de um extrato complexo de Escherichia coli usando CNTs, comparando a eficiência do processo com outros materiais de carbono com diferentes estruturas e modificações de superfície. A amostra de lisado celular, além de conter a biomolécula de interesse, o RNA, contém proteínas bem como outros ácidos nucleicos contaminantes, como RNA e DNA genómico (gDNA). Os ensaios realizados no presente trabalho podem ser divididos em 2 partes: (1) realização de ensaios de adsorção de RNA usando CNTs de parede múltipla (multiwalled carbon nanotubes, MWCNTs) e avaliação de diferentes estratégias de regeneração dos MWCNTs para serem aplicados em novos ciclos, uma vez comprovada a incapacidade de dessorção de RNA deste material, em condições favoráveis à manutenção da sua integridade e estabilidade; (2) realização de ensaios de screening de adsorção e dessorção de RNA utilizando CNTs e outros materiais de carbono; estudo da reutilização dos materiais; avaliação do potencial de seletividade entre RNA e pDNA a partir de misturas de ácidos nucleicos e de amostras complexas de lisado, com posterior caraterização da pureza relativa e integridade do RNA recuperado. Os resultados obtidos da primeira parte do trabalho demonstraram o enorme potencial dos MWCNTs em adsorver RNA, exibindo uma capacidade máxima de adsorção de aproximadamente 175 mg/g. Quanto à capacidade de reutilizar este material, foram aplicadas estratégias de regeneração química, ultrassónica e térmica, sendo que, quando aplicada a regeneração química seguida de novo ensaio de adsorção de RNA, foi obtida a melhor percentagem de adsorção (73%) comparativamente às restantes estratégias mencionadas. Através da análise FTIR dos MWCNTs, demonstrou-se que o material foi capaz de recuperar as propriedades iniciais de superfície após terem sido aplicadas as estratégias de regeneração química e térmica. Relativamente aos resultados dos ensaios referentes à segunda parte do trabalho, foram realizados ensaios de screening de adsorção e dessorção de RNA a partir de diferentes materiais de carbono. Entre eles, os CNTs dopados com N e oxidados com HNO3 e as fibras de carbono oxidadas com HNO3, apesar de apresentarem capacidades de adsorção de RNA mais baixas, de 42% e 55% respetivamente, quando comparadas com MWCNTs e outros CNTs sem qualquer modificação de superfície, demonstraram ser capazes de dessorver o RNA capturado, obtendo percentagens de dessorção do RNA de 81% e 72%, respetivamente. Além disso, demonstrou-se a possibilidade de reutilização e reaproveitamento dos materiais pois estes foram capazes de manter a capacidade de adsorção de RNA ao longo de vários ciclos. Os resultados obtidos revelaram também a capacidade dos materiais em capturar com alguma seletividade o RNA de amostras complexas e, posteriormente, recuperá-lo sem a presença de DNA, ao longo de 3 ciclos. De notar que os CNTs dopados com N e oxidados com HNO3 apresentaram uma maior seletividade em comparação com as fibras de carbono oxidadas com HNO3. Os resultados evidenciaram também que os materiais foram capazes de capturar totalmente a quantidade de proteínas presente na amostra de lisado, sendo que no caso dos CNTs dopados com N e oxidados com HNO3 foi apenas necessário 1 ciclo de extração para capturar a totalidade de proteínas presente. A par disso, a recuperação final de RNA não foi comprometida, dado que as frações representativas de RNA dessorvido não continham a presença de proteína, possibilitando a clarificação rápida e simples do RNA. Por último, os resultados relativos aos espetros de dicroísmo circular garantiram a manutenção da integridade e estabilidade do RNA recuperado de ambos os materiais. Assim, globalmente, os resultados obtidos neste trabalho demonstram o potencial dos materiais de carbono em capturar e recuperar o RNA, permitindo o desenvolvimento de um método simples, rápido e amigo do ambiente para a captura e pré-purificação eficiente de RNA.

2022-11-23Master thesis

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